[发明专利]一种基于大肠杆菌碱性磷酸酶的蛋白激酶检测的方法

摘要

本发明公开了一种基于大肠杆菌碱性磷酸酶的蛋白激酶检测的方法。根据大肠杆菌碱性磷酸酶活性中心的结构特征，设计并构建大肠杆菌碱性磷酸酶突变体，屏蔽其催化能力，保留和磷酸化底物结合的能力，使其成为一种磷酸化蛋白(短肽)通用结合物。将磷酸化蛋白通用结合物固定在BIAcore3000传感器芯片上，加入蛋白激酶短肽底物和激酶反应后形成的磷酸化短肽，通过BIAcore3000传感器的响应信号来鉴定激酶的种类和含量。该方法利用磷酸化蛋白(短肽)通用结合物取代抗体发展蛋白激酶检测新方法，可避免荧光抗体检测方法中特异性磷酸化抗体的难获得性等瓶颈问题，具有很好的应用前景。

主权项

1.一种基于大肠杆菌碱性磷酸酶的蛋白激酶检测的方法，包括下列步骤：A、根据大肠杆菌碱性磷酸酶的空间结构特征和催化机理，对该酶活性中心部位参与催化过程的氨基酸102位丝氨酸进行突变，屏蔽其催化，保留磷酸化底物，突变位点包括：Ser102Ala，Ser102Leu，Ser102Gly；B、突变基因的构建：以含有大肠杆菌碱性磷酸酶编码基因的质粒pEK48为模板，采用重叠PCR方法将突变位点引入大肠杆菌碱性磷酸酶基因；C、大肠杆菌碱性磷酸酶突变基因的表达：将携带有突变基因的质粒转化到宿主菌SM547，在选择性平板上随机挑选转化子，通过测序鉴定阳性转化子，并在LB液体培养基中表达出突变蛋白；D、突变蛋白的制备：大肠杆菌SM547经过夜培养后，离心收集菌体，采用渗透休克法提取周间质蛋白，并采用阴离子交换树脂对突变蛋白进行纯化，纯化后的蛋白液浓缩后，于4℃保存；E、通过酶动力学参数测定分析突变体蛋白与磷酸化底物的结合，筛选出符合目标特性的突变体；F、通过BIAcore3000传感器评价突变体与不同蛋白激酶短肽底物磷酸化位点的结合；G、用筛选到的突变体修饰传感芯片，制备通用的磷酸化蛋白或短肽识别元件，加入蛋白激酶短肽底物和激酶反应后形成的磷酸化短肽，通过BIAcore3000仪器的信号来鉴定激酶的种类和含量。