[发明专利]生物结构HAP/β－TCP组织工程化骨的制备方法

摘要

本发明公开了一种生物结构HAP/β－TCP组织工程化骨的制备方法，包括1.以牛股骨下端松质骨为原料，经祛除骨髓、脂、蛋白，漂洗、干燥，高温处理，获得HAP，将HAP与NH₄H₂PO₄反应后再次高温处理，得到生物结构HAP/β－TCP材料支架；2.骨髓基质干细胞体外分离后接种于培养瓶，加DMEM培养液入孵箱37℃5％CO₂培养，2～3天换一次培养液，细胞生长达90％时胰蛋白酶消化，传代培养，使骨髓基质干细胞数量达到10⁶～10⁷个/ml后备用；3.将生物结构HAP/β－TCP材料支架超声清洗后，把传代培养后的细胞均匀滴在支架上进行诱导培养，细胞长满支架材料内部孔隙后成为生物结构HAP/β－TCP组织工程化骨，其微结构与松质骨完全相似，便于体内成骨及支架材料降解、降解速度可控，加快了骨缺损的修复，在骨移植领域中有广阔的应用前景。

主权项

1.一种生物结构HAP/β-TCP组织工程化骨的制备方法，包括制备具有生物结构的HAP/β-TCP复合材料支架，骨髓基质干细胞体外分离、扩增及向成骨细胞定向诱导，构建组织工程化骨，其特征在于：(1)生物结构HAP/β-TCP复合材料支架的制备，用成年牛的椎体、股骨头或股骨下端松质骨为原料，经多次清洗祛杂及化学方法祛除脂类、蛋白后，再经多次漂洗、脱水后干燥，进行第一次高温处理，温度从低到高的区间内设置多个温度程序段，以获得保持松质骨小梁结构的HAP，将HAP与0.5-2.0M浓度的NH4H2PO4反应1-8小时后，经第二次高温处理，获得HAP与β-TCP比例为80-30比20-70的生物结构HAP/β-TCP复合材料支架；(2)骨髓基质干细胞体外分离、扩增，在被抽取动物体内常规局部麻醉，髂后上嵴穿刺，抽取骨髓液约2-10ml，肝素抗凝，PBS稀释，加入淋巴细胞分离液(Ficoll)分离液梯度离心，将MSC层吸出，加入PBS，离心，接种于培养瓶，加入高糖DMEM培养液，入孵箱37℃ 5％CO2培养，根据细胞生长状况进行换液，平衡PH值，细胞生长达90％时进行传代培养，细胞传代消化使用胰蛋白酶，传代培养数次后骨髓基质干细胞数量达到106 -107个/ml后收集备用；(3)构建组织工程化骨，将上述生物结构HAP/β-TCP材料支架在高纯水中超声清洗、干燥、封装、消毒，用前将材料于少量培养基中浸泡并在超净台中晾干，将106-107/ml细胞均匀滴在块状支架材料上，37℃5％CO2孵育2-5小时，再加入培养基，24小时后高糖DMEM培养基换成诱导培养基，每2-3天换一次诱导培养基，12-16天细胞长满支架材料内部孔隙后构建成具有生物结构的HAP/β-TCP的组织工程化骨。