[发明专利]活菌微量检测方法

摘要

活菌微量检测方法，涉及一种病原性活菌，提供一种微量快速检测病原性活菌的方法。步骤为免疫捕捉，将针对病原菌的特异性抗体包被至已经预加碳酸缓冲液的固相载体各孔中静置或孵育，用含有非离子型去污剂的磷酸盐－吐温缓冲液洗板；加入小牛血清封闭甩干；加入细菌溶液，温育得病原菌；捕捉到病原菌后，在固相载体的各孔中加入培养基，培养后离心，丢弃上清，加入无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板；取无菌的新枪头分别吸加10×PCR缓冲液，dNTP，MgCl₂溶液，两条引物，Taq酶及PCR反应模板于PCR管中心至管底；扩增后取PCR产物电泳上样缓冲液混合，点样于琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。快速简便，高效灵敏。

主权项

1、活菌微量检测方法，其特征在于其步骤为：1)免疫捕捉：将1～1000μg/mL的针对病原菌的特异性抗体包被至已经预加每孔40～300μl；pH为9.2～10.8，浓度为0.01～0.1mol/L的碳酸缓冲液的固相载体各孔中，静置或者孵育，然后用含有0.05％～3％的非离子型去污剂；pH为6.4～7.6的磷酸盐—吐温缓冲液洗板至少1次；每孔加入至少50μL 10％小牛血清，37℃封闭至少30min，甩干；每孔加入细菌溶液50～300μl，温育得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌；2)制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉到病原菌后，在固相载体的各孔中均加入新鲜灭菌LB培养基50～300μl，于37℃分批培养后把培养物分别吸到离心管中离心，丢弃上清，加入无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板；3)UPPCR扩增及检测：取无菌的新枪头分别吸加10×PCR缓冲液，dNTP，MgCl2溶液，两条引物：上游引物5’-AAACTCAAAGGAATTGAC-3’；下游引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’，Taq酶及步骤2)中得到的PCR反应模板于各PCR管中，各试剂充分混匀并离心，将PCR反应体系离心至管底；将加好反应体系后的薄壁PCR管置于PCR扩增仪中，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2.5min，共40个循环；72℃再延伸10min。扩增后取PCR产物至少5μl，与1/10～1/5体积的电泳上样缓冲液混合，点样于含0.1～1μg/ml溴化乙啶的0.8％～1.5％琼脂糖凝胶中，80～120V电泳，随后在紫外光下观察结果并拍照记录。