[发明专利]一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法

摘要

一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法。在96孔板中加入140微升磷酸钠缓冲液，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液。动态法测量414nm吸光度值，总读数时间为3分钟，每隔20秒读数一次，每次读数之前震动5秒，再加入20微升30毫摩尔/升碘化硫代乙酰胆碱(用磷酸钠缓冲液配制)，马上进行读数。本发明采用动态法检测，显色不受终止剂的干扰，且反应直接在96孔板中进行，缩短了检测周期；采用微量加样法，所需样品及试剂消耗减少。

主权项

1、一种快速微量检测组织乙酰胆碱酯酶的方法。其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行(以小鼠肝脏乙酰胆碱酯酶测定为例)：1)称取约0.05克组织，按1∶10(质量/体积)比例加入冰冷的匀浆缓冲液(20毫摩尔/升Tris·Cl，0.15毫摩尔/升NaCl，pH7.4)，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。2)10000rpm，4℃离心30分钟，取上清。3)在96孔板中加入140微升磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，pH 7.4)，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液(用磷酸钠缓冲液配制)，此为样品组。相应对照组中每孔加入160微升磷酸钠缓冲液，30微升匀浆上清液，10微升7.6毫摩尔/升的DTNB溶液。各孔均用移液器吹打，使之充分混匀，室温放置10分钟。4)设置于酶标仪参数，动态法测量414nm吸光度值，总读数时间为3分钟，每隔20秒读数一次，每次读数之前震动5秒。5)步骤3)到时间后，用排枪向样品组每孔同时加入20微升30毫摩尔/升碘化硫代乙酰胆碱(用磷酸钠缓冲液配制)，马上进行读数。6)另取20微升上清匀浆液，稀释25倍，取100微升进行蛋白定量。7)结果以(样品组每分钟吸光度变化值—相应对照组每分钟吸光度变化值)/毫克蛋白表示。