[发明专利]一种利用酵母生产β－环糊精的方法

摘要

本发明公开了一种利用酵母生产β－环糊精的方法，即利用基因工程技术将环糊精糖基转移酶表达固定在酿酒酵母细胞表面，然后利用表面固定有环糊精糖基转移酶的酿酒酵母细胞发酵生产β－环糊精，在分离纯化产品β－环糊精时，只需要离心去除菌体细胞和剩余底物，然后浓缩反应上清液就可得到相当纯度的β－环糊精产品。本发明的方法在固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，可以重复利用，省去了纯化步骤；而且在生产环糊精的同时酒精的产生以及酵母对葡萄糖和麦芽糖的消耗都促进了环糊精的产生，提高了产率。本发明中所使用的酿酒酵母作为一种已经被广泛应用于食品生产的微生物，所生产的β－环糊精具有不容置疑的安全性。

主权项

1.一种利用酵母生产β-环糊精的方法，由下述步骤组成：(1)重组表达载体的构建：克隆环糊精糖基转移酶基因，经EcoRI和XhoI酶切后插入酵母表达载体pYD1，命名为pYD1/cgt；(2)重组酵母菌株的构建：将表达载体pYD1/cgt在转化效价高的大肠杆菌中扩增后，用电转化的方法将其转入酵母菌中，构建重组酵母菌株；在不含色氨酸的YNB-葡萄糖平板上长出的菌落为阳性克隆工程菌株；(3)环糊精糖基转移酶诱导表达：将上述阳性克隆工程菌株，接种于YNB-CAA葡萄糖培养基中，25-32℃培养20-30小时，摇床转速为220-260转/分；当YNB-CAA葡萄糖培养基中菌体浓度达OD＝2-5时，将菌体离心收集后转入YNB-CAA半乳糖培养基中，使YNB-CAA半乳糖培养基中菌体浓度达到OD＝0.5-1.0；诱导培养，诱导温度20-25℃，摇床转速为220-260转/分，诱导30-36小时，得到细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌；(4)利用细胞表面表达有环糊精糖基转移酶的酵母生产环糊精：将上述细胞表面表达有CGTase的酵母工程菌收集后转入含有淀粉的YNB-CAA半乳糖发酵液中发酵或转入转化反应液中进行反应；之后，以12000转/分离心30分钟去除酵母菌体和残余底物，得到含有环糊精的上清液；其中：发酵条件为20-35℃，摇床转速220-260转/分，发酵时间48-96小时；转化反应液反应条件为20-50℃，反应36-72小时，同时利用100-160转/分的速度摇动以防止菌体沉淀；(5)产品β-环糊精的分离纯化：将上述含有环糊精的上清液以常规方法浓缩，当上清液被浓缩至其原体积的10％～20％时，析出物即为β-环糊精，停止浓缩，将浓缩后的上清液以12000转/分离心30分钟，沉淀物即是纯化的β-环糊精。