[发明专利]建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法

摘要

本发明公开了一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，该方法将已脱离关中奶山羊体的耳中部一块0.5cm×0.5cm大小的皮肤，切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，在37℃、5％CO₂、饱和湿度的恒温培养箱内培养，培养后离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入塑料皿中，用无血清培养基培养，待干细胞增殖至70％～80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养，直至传至25代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。本发明的方法建立的关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，不仅可用于克隆转基因动物的研究和生产，而且可用于该品种的遗传特征研究与保种；同时也是组织工程皮肤研究的理想实验材料。

主权项

1.一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，其特征在于，包括下列步骤：1)将已脱离关中奶山羊耳中部的一块0.5cm×0.5cm大小的皮肤，在无菌间用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与软骨分离；并将该皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，培养基配方：90％Medium199+10％FBS+10μg/mL Insulin+10ng/mLLIF+(1-1.5μg/mL)氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；在37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，每2d换一次培养基；3)倒置显微镜下观察细胞生长情况：3d～4d后，在组织块四周有上皮样细胞呈铺路石样生长，7d～12d后，在上皮样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长；该类细胞的胞体透亮、折光性强、体积小、核质比高、细胞呈球形，具有干细胞形态学特征；4)待这些干细胞克隆增殖到直径约为100um～150um时，在解剖镜下将其挑选出来，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入塑料皿中，塑料皿中铺有明胶；每皿接种5000～10000个细胞；5)用无血清培养基培养，第3天后换一次无血清培养基；此后每两天换一次无血清培养基；无血清培养基培养配方为：100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20～25ng/mL)EGF+(15～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；6)待干细胞增殖至70％～80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养，直至传至25代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。