[发明专利]人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

摘要

人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－IFNα2 cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中进行表达；本发明的融合蛋白包括与人α2干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人α2干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

主权项

1、人α2干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是IFNα2cDNA通过RT-PCR从经新城鸡瘟病毒诱导的人淋巴细胞RNA中直接扩增得到；HSAcDNA通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得；获得的IFNα2 cDNA和HSA cDNA分别插入到克隆载体中，测序；利用重叠PCR技术，连接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IFNα2 cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IFNα2 cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达；(1)IFNα2 cDNA的克隆：取正常人外周血加淋巴细胞分离液，分离出人血白细胞，用含有5％胎牛血清的DMEM培养基稀释至细胞浓度为5×107个/ml，加入新城鸡瘟病毒到100血凝单位/ml，37℃，5％CO2，培养1小时，使病毒吸附在细胞上，1000×g离心弃上清，加入新鲜的有5％胎牛血清的DMEM培养基，37℃，5％CO2，培养18小时；用RNA提取试剂盒分离总RNA，用一步法RT-PCR试剂盒反转录为cDNA并从中扩增出IFNα2，所用的引物如下：Pa2b1：5’-AGAGTCGACATGTGTGATCTGCCTCAA-3’Pa2b2：5’-GCCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3’一步法RT-PCR反应体系配制如下：10×one step RNA PCR Buffer 5μl25mM MgCl2 10μl10mM dNTP 5μlRNase inhibitor(40U/μl) 1μlAMV-optimized Taq 1μlAMV RTase XL(5U/μl) 1μl10μM Pa2b1 2μl10μM Pa2b2 2μl提取的总RNA 1μlRNase Free H2O 22μl总体积 50μl反应条件为：50℃30分钟，94℃变性2分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带；用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段；纯化好的目标片段和载体pBlueScriptII KS(+)，经SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-IFNα2，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-IFNα2；(2)HSA cDNA的克隆：利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：HSA1：5’-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’HSA2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的HSA1和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBlueScriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和IFNα2 cDNA融合基因的克隆：HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：Pf1：5’-CCCTCCGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’Pf2：5’-TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；IFNα2 cDNA的PCR扩增，所用引物如下：Pf3：5’-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA-3’Pf4：5’-CATAAGGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的Pf3和Pf4的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFN α21ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合HSA和IFNα2 cDNA：将IFNα2的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，继续做30次循环；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带；用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标片段；纯化好的目标片段HSA-IFNα2和载体pBlueScript II KS(+)，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1 blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA-IFNα2，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-HSA-IFNα2；(4)HSA-IFNα2酵母表达系统构建：取一支冻存的XL-l/pBlue-HSA-IFNα2，20ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；质粒pBlue-HSA-IFNα2和酵母表达载体pPIC9K，经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收；用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取若干个菌落，分别接种于20ml 100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC-HSA-IFNα2，阳性重组子命名为DH5α/pPIC-HSA-IFNα2；提取DH5α/pPIC-HSA-IFNα2中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71；提取酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组子；阳性重组子命名为KM71/pPIC-HSA-IFNα2；(5)HSA-IFNα2融合蛋白的表达：将KM71/pPIC-HSA-IFNα2接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体；将收集到的菌体接种至装有20mlBMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天；离心收集上清，过滤除菌，用细胞病变抑制法测定上清中的HSA-IFNα2活性；Western杂交检测产物HSA的免疫源性。