[发明专利]基于H－Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法

摘要

一种基于H－Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，选择H－Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法扩增后连接，获得只编码这4个抗原决定簇的基因重组体并将其亚克隆入表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21中诱导表达、Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白。将融合蛋白免疫圈养鸡，从蛋黄中提取多克隆抗H－Y抗原的鸡IgY抗体并用纳米级磁珠标记，在新鲜奶牛精子中加入磁珠标记的抗体，反应后的精子缓慢通过放置于磁场中的磁柱，未吸附在磁柱上的精子即为X精子。本发明不需特殊的设备，成本低廉，获得的特异性抗体对X精子不会造成损伤，可在短时间内大批量进行精子分选。

主权项

1.一种基于H-Y抗原分选奶牛X精子的免疫磁珠负筛选法，其特征在于包括如下步骤：1)选择H-Y抗原所特有的4个抗原决定簇，利用反转录聚合酶链反应法分别扩增这4个抗原决定簇的DNA序列，并将这4个DNA序列连接在一起，从而获得一个总长1079bp、编码所选定的4个H-Y抗原决定簇的基因重组体；2)将该基因重组体经亚克隆入表达载体pET28a后，在大肠杆菌BL21中诱导表达、Histrap柱纯化后获得一分子量为37kDa的融合蛋白；3)将上述获得的融合蛋白免疫圈养鸡，共3次，每次间隔14天，末次免疫10天后开始收集鸡蛋；用氯仿-聚乙二醇法从蛋黄中提取多克隆抗H-Y抗原的鸡IgY抗体；4)将上述获得的抗H-Y抗原的鸡IgY抗体用纳米级的磁珠标记，然后取新鲜奶牛精子样本，每108个精子细胞中加入0.5mg磁珠标记的抗体，充分反应后，将精子样本缓慢通过放置于磁场中的磁柱，收集未吸附在磁柱上的精子，即得到奶牛的X精子。