[发明专利]利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用

摘要

本发明公开了一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用，首先是水稻特异性启动子及信号肽的获得；其次是水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建；第三是使用水稻偏爱密码子合成作为融合载体的水稻非储藏蛋白Bip基因C－末端和小麦PD1基因C末端以及类胰岛素生长因子－1基因；第四是表达融合蛋白载体的构建。第五是获得融合蛋白表达量达到0.3％以上种子干重的转基因水稻和大麦植株。本发明方法简单，操作方便，成本低廉，此发明可应用于在谷物胚乳中表达各种多肽。

主权项

1、一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法，它包括下列步骤：A、水稻特异性启动子及信号肽的获得：采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的Gt13a基因的启动子，为了获得Gt13a启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Gt13a合成了一对核苷酸引物用于PCR扩增，为了基因克隆，在正向引物的5’端加入了一个粘性末端的内切酶位点，在反向引物的5’端加了另一个平末端的内切酶位点，从水稻品种台北309叶片中提取基因组DNA，以此DNA为模版，按照PCR程序，利用上述引物扩增出了一个1284碱基的DNA片段；B、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：经PCR获得Gt13a启动子和信号肽的序列后，PCR产物经粘性末端内切酶与平末端的内切酶消化后，将这个片段与经同样的内切酶消化的pBI221片段连接，然后导入大肠杆菌品系DH10B，形成了含有Gt13a启动子、Gt13a信号肽和Nos终止子的水稻胚乳特异性表达的载体，这个载体质粒为pOsPMP2；C、融合蛋白和目的基因的密码子优化：从基因库里获得水稻遗传密码子的水稻Bip基因C-末端、小麦PDI基因C末端和目的基因类胰岛素生长因子的氨基酸序列，使用水稻偏爱的遗传密码子，由DNA分析软件马克载体将基因的氨基酸序列转换成含有优化的水稻遗传密码子的核苷酸序列，在基因合成时，在5’和3’末端分别加上限制性内切酶MylI和XhoI，便于基因克隆；D、表达融合蛋白载体的构建：首先是pOsPMP25的构建，将pOsPMP2质粒DNA用MscI和XhoI进行双酶切，然后经PCR扩增的密码子的人类胰岛素样生长因子基因片段克隆到pOsPMP2载体中，转化E.coli宿主细胞DH10B，产生一个含有IGF-1基因的中间质粒pOsPMP3，再用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的PDIC的DNA片段克隆到中间质粒载体，形成了水稻特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP25；其次是pOsPMP26的构建：用限制性内切酶NaeI和NcoI消化pOsPMP3质粒DNA，将PCR扩增的BipC DNA片段克隆到pOsPMP3质粒载体，形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体pOsPMP26；第三是选择性标记基因载体的构建：为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内表达，采用水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子介导选择性标记基因在愈伤组织中表达，a、合成了一对PCR引物，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，在PCR引物的两端加了HindIII和SmaI位点；b、以水稻品种台北309的基因组DNA为模版，采用标准PCR反应，扩增出一个长度为1103碱基含有启动子的片断，PCR产物经HindIII和SmaI消化后，该PCR片段与克隆载体pBI221连接，然后转化大肠杆菌品系DH10B，产生了中间质粒pOsPMP4；c、选择性标记基因采用潮霉素B磷酸转移酶基因，该基因从质粒pCAMBIA1301扩增，在正向引物，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9的5’末端加上了一个平末端限制性内切酶位点SmaI，在反向引物的5’末端加上了一个粘性末端的限制性内切酶位点XhoI，以pCAMBIA1301质粒为模版，采用PCR反应，扩增出潮霉素B磷酸转移酶基因片断，PCR产物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4DNA用NaeI和XhoI消化，然后将潮霉素B磷酸转移酶基因片断与CP启动子的pOsPMP4质粒经NaeI和XhoI消化的DNA片段连接，转化大肠杆菌菌系DH10B，产生了水稻组织特异性表达的选择性标记表达载体，为pOsPMP5。