[发明专利]一种检测人脑脊液中Tau蛋白含量水平的方法

摘要

本发明属于医疗评价、检测技术领域，具体涉及一种检测人脑脊液中Tau蛋白含量水平的方法。本发明通过热休克(heat shock)方法实现脑脊液样品预处理，利用了Tau蛋白所特有的热稳定性，通过在温控混匀器中搅拌加热，使脑脊液中其他蛋白成分变性并沉淀，并通过离心沉降其他被热休克法变性的蛋白不溶物，实现其他蛋白组分的预去除。对Tau蛋白成分进行有效富集，并在电泳胶上实现蛋白质分离，银染法蛋白质高灵敏检出。本发明所采用的是化学与物理的方法，试剂中不包括任何抗体等生化产品，性能稳定，便于运输、储存，对实验室条件要求低，过程简便，快速，具有适用于临床使用的优点。

主权项

1、一种检测人脑脊液中Tau蛋白含量水平的方法，其特征在于具体步骤如下：(1)脑脊液的预处理取脑脊液1.5～2.0ml，置于2ml离心管中，与摩尔浓度为480-520mmol/dm3的磷酸盐样品缓冲液混合，得混合液，缓冲液与脑脊液样品体积比为(0.09～0.1)∶1，缓冲液pH值为7.0～7.5；混合液在温控混匀器中振荡加热8～10分钟，得热解液，振荡速度为500～600转/分，加热温度为90～99℃；将热解液冷却至室温，离心管置于离心机内，以转速为4000～5000转/分的速度离心分离15-20分钟，取上清液；所得上清液移至超滤管离心分离50～60分钟，离心力为4000～5000g，其中的水溶液透过超滤膜，蛋白质样品溶液停留于膜上，蛋白质样品溶液浓缩40～80倍，至浓缩液体积为30～50μl；浓缩液移置离心管中，与电泳样品缓冲液混合，在温控混匀器上90～100℃温度下，振荡加热3～5分钟，电泳样品缓冲液与浓缩液体积比为1∶4～1∶5，所得混合溶液移至凝胶胶板进行电泳分离；(2)凝胶电泳分离将步骤(1)中所制成的凝胶胶板置于电泳槽中，电泳槽内加入pH值为8.0～8.5的电泳缓冲液，上槽加满，下槽加至浸没凝胶底部，开启电泳仪电源，调整电流或电压，保持凝胶温度低于40℃，对凝胶进行电泳分离，电泳分离时间为2～3小时；(3)银染色将经过电泳的凝胶胶板移至含质量百分比为50％的甲醇和质量百分比为10％醋酸的水溶液中，浸泡，清水漂洗，漂洗后的凝胶胶板移入容器内，用银氨溶液染色15～20分钟；然后用去离子水漂洗，用柠檬酸/甲醛显色液洗涤，显色，10～20分钟内出现银染的电泳带，否则更换显色液，显色完成后，将凝胶浸入质量百分比为1～1.5％醋酸终止反应，在蒸馏水中漂洗凝胶1～3小时，保存；(4)定量分析将所得的凝胶胶板置于扫描仪，进行图像扫描，得到各蛋白条带图像，通过图像分析，确定样品蛋白条带的黑度值；(5)推算Tau蛋白含量数值配制不同浓度的标准Tau蛋白溶液。用标准Tau蛋白溶液代替脑脊液，重复步骤(1)至步骤(4)的方法，根据各标准Tau蛋白溶液的浓度及其对应位置的Tau蛋白条带的黑度值，绘制标准曲线。样品Tau蛋白条带的黑度值，按标准曲线计算，即可推算出样品中Tau蛋白含量数值。