[发明专利]一种荔枝多糖含量的测定方法

摘要

本发明涉及一种荔枝多糖含量的测定方法。本发明提供了一种在用苯酚-硫酸法测定荔枝多糖时解决蛋白质干扰的方法，其主要内容包括：(1)粗多糖的制备；(2)精制荔枝多糖的制备；(3)样品液制备和测定；(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定；(5)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立；(6)样品液蛋白质产生的吸光度计算；(7)样品多糖含量计算。本发明对荔枝多糖产品生产工艺优化、质量监测、标准制定等方面是必不可少的。本发明的原理也可以用在其它含蛋白质多糖产品的测定上，在目前多糖的研究、开发及应用异常活跃的形势下，具有重要的理论和实践意义。

主权项

1、一种荔枝多糖含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：(1)粗多糖的制备：荔枝干肉加6-8倍蒸馏水，60℃水浴保温30分钟，打浆，95℃水浴浸提4-5h，趁热过滤，用高速冷冻离心机以20000-30000r/min离心10-15min，去渣，真空浓缩至1/4体积，加入4倍体积无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀即得荔枝粗多糖；(2)精制荔枝多糖的制备：荔枝粗多糖依次用石油醚、丙酮回流脱脂，挥干溶剂，用80％乙醇回流去其它可溶性糖类物质，置80℃烘箱中5h挥干溶剂后溶于50倍蒸馏水中，加入10-15％(V/V)H2O2脱色，然后加4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min，收集沉淀，置80℃烘箱中5h挥干溶剂。沉淀加入30倍蒸馏水，并加入0.05-0.1％(W/V)NaOH，90℃热水浴中保温1h使其溶解，然后加入0.5％木瓜蛋白酶，60℃恒温处理10h，用高速冷冻离心机以10000-20000r/min离心10-15min。上清液加入1/5体积氯仿，1/25体积正丁醇振荡20min，用分液漏斗分出水相，此步骤重复5次，然后用蒸馏水透析48h，然后透析液加入4倍体积的无水乙醇，静置12h，3000-5000r/min离心10-15min取沉淀，真空干燥至恒重，即得精制荔枝多糖；(3)样品液制备和测定：荔枝干肉剪碎，精密秤取10g，加500mL80％酒精浸泡过夜，然后于索氏提取器中回流4h，残渣挥去溶剂后，用蒸馏水回流提取4h，然后用蒸馏水反复洗至250-300mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀备用。样品液多糖用苯酚-硫酸法测定，步骤如下：精密吸取样品液0.2mL于带塞试管中，加蒸馏水至2mL，再依次加入6％苯酚溶液1.0mL，浓硫酸5.0mL，置沸水浴中15分钟，然后快速冷却至室温，以蒸馏水做参比，在490nm下用1cm比色杯测其吸光度，得到吸光度A样品总；样品中蛋白质含量测定用Bradford法，步骤如下：取样品液0.1mL加至5.0mL考马斯亮蓝试剂中，5min钟后于595nm处测吸光度，再根据蛋白质的标准曲线得出样品中蛋白质含量；(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定：称取600mg的荔枝粗多糖，溶解于200-300mL的蒸馏水中，配成多糖浓度为2-3mg/mL的母液，然后分别吸取母液0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5mL于试管中，用蒸馏水补充至10mL，混匀，得到一系列粗多糖溶液。用Bradford法测出各粗多糖溶液的蛋白质含量并计算出总量；由于粗多糖中最主要杂质为杂蛋白，那么用粗多糖溶液中粗多糖总量减掉蛋白质总量即可得出各粗多糖溶液中净多糖的总量，由此可算出各粗多糖溶液中净多糖的含量；(5)多糖含有的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立：根据步骤(4)得到的各粗多糖溶液中净多糖含量，用精制荔枝多糖配成与其一一对应的同样浓度，得到系列精制多糖溶液。分别精密吸取相同多糖浓度的粗多糖溶液及精制多糖溶液0.1mL于带塞试管中，余下步骤按苯酚—硫酸法测定出各多糖溶液的吸光度，可以分别得到粗多糖溶液的吸光度A粗及精制多糖溶液的吸光度A精，那么A粗与A精的差值即为蛋白质产生的吸光度A蛋白。以蛋白质产生的吸光度(A蛋白)对各粗多糖溶液中蛋白质浓度(C)作回归处理，可以得到一个回归方程；(6)样品液蛋白质产生的吸光度A蛋白计算：根据步骤(3)测得的样品液中蛋白质含量，和步骤(5)所得回归方程就可以计算出此浓度的蛋白质在苯酚-硫酸法测定多糖时产生的吸光度A蛋白；(7)样品多糖含量计算：根据步骤(3)测得的样品液吸光度A样品总和步骤(6)所得的蛋白质产生的吸光度A蛋白，可以按如下公式算出样品多糖在490nm处真正的吸光度A样品：A样品＝A样品总-A蛋白 最后由A样品根据步骤(4)葡萄糖标准曲线回归方程可以计算出样品液中葡萄糖浓度(C)，然后按下面公式可以计算出荔枝多糖的含量：多糖含量(％)＝C*D/W/106*100式中：多糖含量以葡萄糖计C—为供试液中葡萄糖浓度，μg/mL；D—多糖稀释倍数；W为供试样品的重量，g。