[发明专利]一种检测盐酸克伦特罗的试剂盒及其检测方法

摘要

一种检测盐酸克伦特罗的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对动物性食品、血液及尿液中盐酸克伦特罗(CBL)含量的检测。本发明配制的试剂盒，微孔板包被有CBL－OVA，加入CBL标准或样品，再加入CBL抗体。游离的CBL与微孔板上的CBL－OVA竞争CBL抗体，没有连接的CBL抗体被洗涤除去，加入EU³⁺－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的EU³⁺－羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的CBL浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中CBL的含量。本发明提供的检测CBL试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，最低检测浓度为小于0.05ng/ml，相应的最低检测量为小于25ng/kg。

主权项

1.一种检测盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，缓冲液(2)，盐酸克伦特罗标准(3)，盐酸克伦特罗的抗体冻干品(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成；包被板(1)：包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6 Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将盐酸克伦特罗-卵清蛋白稀释至1mg/L作为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加200μl含质量浓度0.2％明胶的50mmol/LpH7.2的Tris-HCl的缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存；缓冲液(2)：8mmol/L NaCl、质量浓度0.1％明胶、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1ml/L Tween-80和含质量浓度0.1％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8；盐酸克伦特罗标准(3)：共6瓶，盐酸克伦特罗浓度分别为：0ng/ml，0.05ng/ml，0.25ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，25ng/ml，稀释液为pH7.4 10mmol/L的PBS；盐酸克伦特罗的抗体冻干品(4)：用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mg盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，血清进行鉴定，合格后稀释、分装、冻干备用；铕标记的羊抗兔抗体(5)：取溶解于50mmol/L PBS pH7.0的5g/L羊抗兔抗体1-2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/L NaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3 pH8.5-9.0缓冲液，收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量，用上述洗脱液稀释羊抗兔抗体至2g/L，取500-1000μl稀释后的羊抗兔抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸的小瓶中，28-30℃磁力搅拌反应16-20小时，反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的1×40cmSephadex-G50柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用；洗涤液(6)：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和含质量浓度0.2％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8；增强液(7)：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液含15μmolβ-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1ml曲拉通X-100。