[发明专利]一种成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法及应用

摘要

本发明涉及一种分离与培养成人皮肤青春细胞的方法及应用，属于生物技术领域。本发明采用两步胰酶不同消化法成功的从成年人及动物体表皮肤中分离获得了纯净的真皮成纤维细胞并规模化培养，解决了由传统胰酶一步法消化造成的获得产生的细胞种类混乱，成纤维细胞数量少，细胞活力差的问题；可供皮肤美容除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及烧伤后人工复合皮肤的制备及其它目的所需。本发明采用了经严格而可靠的灭菌灭病毒处理的正规生物制品人白蛋白制剂替代常规动物血清培养细胞，克服了细胞培养过程中可能遇到的其它动物血清中的人兽共患病病原的污染；解决了由此造成的可能引起被注射者针对异种动物血清蛋白的过敏反应问题。

主权项

1.一种成人皮肤青春细胞的分离与规模培养方法及应用，其特征在于以下步骤：(1)首先无菌从耳后或前臂内侧皮肤细嫩处取一块约0.3cm宽，1.0cm长的皮肤，放入特制的保存液中，放入预冻有冰的冰壶内，迅速(通常8小时内)送交专业实验室分离，保存液配方：含1-20％人白蛋白，100u/ml青、链霉素的M199培养液；(2)将皮肤取出，放入50mm无菌塑料平皿内，用无菌眼科剪除去多余的皮下组织和脂肪；然后用含青、链霉素的磷酸盐缓冲液洗液漂洗数次，洗去皮肤表面的血污和毛发，洗液配方：含青、链霉素(100u/ml)的磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)；(3)将皮肤转入6孔培养板，用2ml预冷的4-16C消化6-24小时，消化液配方一：0.1-1％的胰酶，pH 7-9Hank’s液配制；(4)轻吸弃消化液，用无菌眼科镊剥离表皮与真皮层，将真皮层细胞转移至新孔，加入2ml新的消化液(二)，37C，消化30分钟～4小时，消化液配方二：0.25％胰酶-0.02％乙二胺四乙酸二钠(1∶1体积)；(5)吸弃消化液，加入预冷的2ml生长液，终止消化反应，用力吹打分散细胞，静置10分钟，取中间无明显组织块的悬液于新孔，37C，5％CO2，静置培养，生长液配方：含1-20％人白蛋白M199培养液；(6)培养3-7天，待成纤维细胞生长铺满50-70％孔时，吸弃生长液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗一次；加入2ml新的消化液(二)，37C，消化10分钟，吸弃消化液，换7ml新生长液重新悬浮细胞并传入T25cm2细胞培养瓶，37℃，5％CO2，继续静置培养；(7)视情况3-4天换液一次，一周传代，每次传2-3瓶；(8)待细胞总数扩至108，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗1次后，2～5ml消化液(二)，37C，消化10分钟，吸弃消化液，磷酸盐缓冲液(pH7.4 0.01M PBS)漂洗4次，重悬于2-4ml注射液中备用，注射液配方：107-8+5％人白蛋白溶液；(9)采用以上分离培养的成纤维细胞可用于并不局限于皮肤除皱、疤痕修复、皮肤组织填充、皮肤损伤后修复及人工复合皮肤的制备。