[发明专利]酵母细胞表达人白细胞介素24的方法

摘要

本发明公开一种酵母细胞表达人白细胞介素24的方法，该方法先是通过克隆一种IL－24基因或具有一个碱基突变的IL－24基因；然后将它们构建到三种表达载体pPIC3.5K、pPIC9K或pA0815上，构建获得8种表达载体；再选用His^－的毕赤酵母GS115株、KM71株或SMD1168株作为宿主细胞，用酵母细胞进行胞内可溶性表达或胞外分泌性表达，从而获得稳定、高效表达人白细胞介素24，保证了IL－24正确的空间结构及其生物学活性。

主权项

1、一种酵母细胞表达人白细胞介素24的方法，其特征在于：它选用His-的毕赤酵母GS115株、KM71株或SMD1168株作为宿主细胞，整合性表达质粒是pPIC3.5K、pPIC9K或pAO815；该方法包括：(1)克隆人IL-24基因：以ConA刺激人外周血单个核细胞的总mRNA为模板，先RT-PCR扩增出总cDNA，再用IL-24特异引物扩增出带有原始信号肽的IL-24或突变IL-24，即命名为mIL-24或smIL-24，或扩增出不带有原始信号肽的IL-24或突变IL-24，即命名为IL-24或sIL-24；IL-24和mIL-24的cDNA序列与GENBANK公布的序列完全一致，smIL-24和sIL-24的cDNA序列与Genbank公布的序列对比在同一位置发生碱基的点突变，并由此引起一个氨基酸的变化，核酸和氨基酸的序列表1；(2)体外构建重组表达载体，可以是分泌性表达载体，也可以是可溶性表达载体：1)体外构建重组分泌性表达载体：a)将不带原始信号序列的IL-24或sIL-24分别重组到整合型表达载体pPIC9K的多克隆位点EcoR1和Not1之间，得到带有α因子的分泌型表达载体IL-24/pPIC9K或sIL-24/pPIC9K；或者，将不带原始信号序列的IL-24和sIL-24分别与α-因子连接而成的融合基因重组到载体pAO815的EcoR I位点，利用Bgl II和BamH I内切酶在pAO815上体外构建多拷贝表达盒，获得带有α因子的分泌型多拷贝表达载体n(αIL-24)/pAO815和n(αsIL-24)/pAO815；b)将带有原始信号序列的mIL-24或smIL-24分别重组到整合型表达载体pPIC3.5K的多克隆位点BamH1和Not1之间，得到带有IL-24自身分泌信号的分泌型表达载体mIL-24/pPIC3.5K或smIL-24/pPIC3.5K；2)体外构建重组胞内可溶性表达载体：将不带原始信号序列的IL-24或sIL-24 5’端加上起始密码子ATG，分别重组到载体pPIC3.5K的多克隆位点EcoR1和Not1之间，得到可溶性表达载体IL-24/pPIC3.5K和sIL-24/pPIC3.5K；(3)毕赤酵母转化：将重组质粒用限制性内切酶Sal I或Sac I酶切成线性质粒，通过电穿孔或原生质体法转化毕赤酵母；可溶性表达载体转化SMD1168酵母菌株，获得重组酵母菌株IL-24/pPIC3.5K/SMD1168或sIL-24/pPIC3.5K/SMD1168；分泌型表达载体分别转化酵母菌株GS115或KM71，获得重组酵母菌株IL-24/pPIC9K/GS115、sIL-24/pPIC9K/GS115、mIL-24/pPIC3.5K/GS115、smIL-24/pPIC3.5K/GS115、8(αIL-24)/pAO815/GS115、8(αsmIL-24)/pAO815/GS115、IL-24/pPIC9K/KM71、sIL-24/pPIC9K/KM71、mIL-24/pPIC3.5K/KM71或smIL-24/pPIC3.5K/KM71；(4)毕赤酵母表达人IL-24。