[发明专利]同步检测百合斑驳病毒、百合无症病毒和黄瓜花叶病毒的方法

摘要

本发明提供了一种同步检测百合斑驳病毒(LMoV)、百合无症病毒(LSV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的方法，属植物保护领域。其方案是，通过提取总RNA、多重RT－PCR以及电泳检测等步骤，在同一反应管及同一个热循环条件下对百合感染的LMoV、LSV和CMV三种病毒中的1～3种进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通RT－PCR具有的快速、特异、灵敏的优点外，主要是实现了三种病毒同步检测，降低了成本。

主权项

1、一种同步检测LMoV、LSV和CMV三种病毒的方法，其步骤如下：1)设计引物：(a)设计检测LMoV、LSV两种病毒的下游通用引物LMSV：LMSV 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 V＝A，C或G(b)设计检测LMoV、LSV的上游引物，引物序列如下： 引物名称 引物序列 LMoV-F LSV-F 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-3 5-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3(c)设计检测CMV的上、下游引物，引物序列如下： 引物名称 引物序列 CMV-F CMV-R 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-3 5-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3(d)确定每对引物扩增片段大小： 引物名称 引物序列 扩增片段大小 所检测病毒 LMoV-F LMSV LSV-F LMSV CMV-F CMV-R 5-AAGAAGCACGCTGGACTGC-3 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 5-ATCGGAGGCCGCTCTTCG-3 5-GATGGCTGACTGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTV-3 5-TCGTCCGCGTCGCGGTTC-3 5-TGGGAATCCCTTGGTGCTC-3 1153bp 736bp 590bp LMoV LSV CMV2)总RNA提取：(a)称取百合叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂研磨，研磨液倒入1.5mL离心管中；(b)加入400μL氯仿，混匀后静置5min；(c)12,000rpm离心10min；(d)上清移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；(e)12,000rpm离心10min；(f)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；(g)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；3)RT-PCR：(a)RNA变性：RNA 3μL，LMSV 1μL，CMV 1μL和7.5μL ddH2O混匀，70℃保温10min，之后迅速冰浴；(b)反转录：向上述管中按以下体系加入试剂，振荡混匀，室温放置10min，42℃保温1hr，得到cDNA； 试剂 体积 AMV Buffer AMV(5u/μL) dNTPs(10mmol/L) RNase Inhibitor(40u/μL) 4μL 1μL 2μL 0.5μL(c)PCR：取一新PCR管，按下表体系加入各试剂： 试剂 体积 ddH2O 10×PCR Buffer MgCl2(25mmol/L) dNTPs(10mmol/L) LMSV(20μmol/L) LSV5(20μmol/L) LMoV5(20μmol/L) CMV5(20μmol/L) CMV3(20μmol/L) cDNA Taq酶(5u/μL) 30μL 5μL 3μL 2.5μL 2μL 1μL 1μL 1μL 1μL 2μL 1.5μL 总体积 50μL设置PCR程序为：94℃ 4min，94℃ 1min、53℃～60℃ 1min、72℃ 2min，扩增25～40个循环，72℃延伸10min后4℃保存；4)电泳检测：配制0.8％～2％的琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液环境中，150V稳压电泳90min，之后取出凝胶浸泡在0.5μg/mL溴化乙锭中染色10min，然后在紫外灯下观察并记录结果；5)检测结果分析：根据电泳胶上扩增条带的有无及大小确定百合感染的病毒种类；通过观察，若凝胶中存在大小为1153bp的核酸片段，则说明样品中含有LMoV；若凝胶中存在大小为736bp的核酸片段，则说明样品中含有LSV；若凝胶中存在大小为590bp的核酸条带，则说明样品中含有CMV。