[发明专利]一种人角膜内皮细胞系的构建方法

摘要

一种人角膜内皮细胞系的构建方法，它是以角膜内皮为材料，先将角膜内皮面朝下进行贴板培养，采用时间梯度连续贴膜法获得纯净角膜内皮细胞，在含20％胎牛血清、硫酸软骨素氧化降解物、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛眼生素的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。该技术工艺科学合理，经这种方法所获得的传代细胞目前已传至第106代。本发明的角膜内皮细胞未经任何病毒或癌基因转染，因此获得的人角膜内皮细胞没有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生产和临床应用。

主权项

1、一种人角膜内皮细胞系的构建方法，首先从眼库中取出人角膜，分别用氯化汞溶液和庆大霉素消毒后置于超净工作台中，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入胰蛋白酶溶液消化数分钟后；再把角膜平均剪成4片，按内皮面朝下的方向贴入24孔培养板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5％二氧化碳培养箱中、37℃进行贴板培养，并以时间梯度连续揭膜的培养方法将获得的人角膜内皮细胞，于培养箱中放置12～24小时，在每个培养孔中加入1毫升的人角膜内皮细胞专用培养液，然后置5％二氧化碳培养箱中于37℃培养；每间隔3～5天更换人角膜内皮细胞专用培养液1次，待人角膜内皮细胞长成单层后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬液，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以相同方法进行传代。