[发明专利]细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT－PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT－PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中CK19的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测肿瘤患者的外周血、骨髓、淋巴结及癌组织中CK19 mRNA的表达，为各种乳腺癌、小细胞肺癌的早期诊断、转移、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

主权项

1.细胞角蛋白19(CK19)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征为：它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水；(1)、细胞裂解液I包含0.1mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；(2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水；(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水；(5)、无RNA酶的水通过下列方法制得：向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，20min高压，室温放置备用；(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的；(7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)12-18、3.6U/μl Rnase Inhibitor、72.7mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、182mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/L KCl、11mmol/L MgCl2、水；(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；(10)、PCR反应液包含18.5mmol/L Tris-HCI(pH8.3，25℃)、2.78mmol/L MgCI2、92.6mmol/L KCI、上下游引物(0.37μmol/L)、0.1U/μl Taq酶、dNTP混合物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP，其浓度均为400nmol/L)、水；上下游引物序列分别为：P1：5’-ACT ACA GCC ACT ACT ACA CGA C-3’，P2：5’-CAG AGC CTG TTC CGT CTC AAA C-3’(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：5’-FAM-TCT GGC TGC AGA TGA CTT CCG AAC CA-TAMRA-3’探针的浓度为：2μmol/L，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解；(12)、标准品的序列分别为：1 CAGAGCCTGT TCCGTCTCAA ACTTGGTTCG GAAGTCATCT GCAGCCAGAC51 GGGCGTTGTC GATCTGCAGG ACAATCCTGG AGTTCTCAAT GGTGGCACCA101 AGAATCTTGT CCCGCAGGTC CTGGATGGTC GTGTAGTAGT GGCTGTAGT其浓度为：106copies/μl，TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)溶解；(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有CK19 cDNA的样品(104copies/μl，TE溶解)，阴性对照品为外周血总RNA的反转录产物。