[发明专利]评价培养基分离回收微生物类群能力的快速检测方法

摘要

本发明涉及一种利用聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳(PCR－DGGE)，根据DGGE电泳图谱及谱带相似性系数(Cs)分析，综合评价不同培养基或培养条件回收分离微生物类群能力。本发明可以直观的筛选出能更好的分离回收样品中的微生物类群的培养基，与传统的用形态和生理生化特征鉴定的方法相比，具有快速、简便、准确、重复性高等优点，该检测方法还可以用于快速分析环境微生物种群多样性和群落动态的变化。

主权项

1.一种评价培养基分离回收微生物类群能力的快速检测方法，包括以下步骤：(1)选择用于实验的样品；(2)分离和纯化环境样品中的微生物：将样品制备成10-1～10-5不同的稀释度，分别在不同培养基上涂平板，适温下或不同条件下培养；(3)提取和纯化环境样品中所有微生物的基因组DNA：称取10.0g样品，放入盛有10粒无菌玻璃珠(直径3mm～5mm)的三角瓶中，加15mL提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA-Na2，200mmol/L NaCl，1％PVP，2％CTAB，pH8.0)；在180r/min，37℃条件下振荡30min，然后加入2mL 20％SDS继续振荡10min；65℃水浴1h后6000r/min离心15min，收集上清液，加入0.5倍体积PEG-NaCl溶液(其中含30％PEG和1.6mol/L NaCl)，混匀后室温下静置2h，10000r/min离心20min，沉淀用2mL TE重新悬浮；加4mol/L NaAC(pH5.4)至终浓度0.3mol/L，用酚/氯仿/异戊醇溶液(25∶24∶1)抽提一次，加入0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000r/min离心20min，沉淀干燥后，用200μl TE溶解，再用Wizard@DNA clean-up system(Promega)纯化后，置于-20℃保存，待用；(4)提取不同培养基和培养条件下的平板回收菌总DNA：分别用10ml无菌水洗涤平板，收集菌体；然后提取菌体总DNA；(5)所有样品的16SrDNA V3区进行PCR扩增：取10倍缓冲液5μl，dNTP(10mM)1μl，F341-357(GC)(10μM)1μl，R534-518(10μM)1μl，Taq(5U/μl)0.4μl，模板DNA 2μl，补足ddH2O至50μl。反应程序为94℃ 5min预变性；94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，60～55℃ 30s(-0.5℃/循环)，72℃ 2min，10个循环；94℃ 30S，55℃ 30s，72℃ 2min，15个循环；72℃ 7min。扩增产物采用1.5％琼脂糖分析检验；(6)将PCR扩增产物进行DGGE电泳：聚丙烯酰胺凝胶浓度为8％，变性梯度为35％～60％(100％的变性剂为7mol/L尿素，40％甲酰胺)，180V，60℃恒温，0.5×TAE中电泳4.0h，GoldView染料染色30min，UVI成像系统拍照；用UVIBand分析软件帮助确定样品电泳条带的多少和条带的亮度峰值；(7)DGGE谱带相似性系数(Cs)分析：用Sorenson配对比较不同样品的DGGE指纹图谱的相似性；Cs＝2j/(a+b)，其中a、b表示两个比较对象中的DNA条带数目，j表示a和b中相同的条带数量。