[发明专利]一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法

摘要

一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，属于生物基因技术领域，特别涉及高分子量全基因组超螺旋结构的解旋方法。本发明实质上是对Zollinger等人报道的核酸电镜铺展技术进行了改进：①将铺展液中的SLS浓度提高5倍；②将细胞色素C浓度降至50mg/mL；③操作中辅之以适当的流体切力拌动。本发明可一次性获得充分解旋全基因组超螺旋结构的完整基因组分子；结合于基因组分子上的特异互作蛋白质(酶)分子显示清楚；能直接观察并测定到基因组解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等；所获基因组分子图像背景清晰、反差好、光滑、柔韧、无缠结与断裂、且无纵向伸长。本技术能较好用于生物基因组测序所需的各种定位标记图谱构建、核酸－蛋白质相互作用研究、基因组结构研究等领域。

主权项

1、一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，其特征是，它包括以下步骤：1)、生物完整基因组制备，按常规方法制备并提纯生物基因组DNA分子，并在-20℃温度条件下保存备用；2)、支持膜制备，包括：(1)、利用火棉胶和醋酸异戊酯制成2％火棉胶醋酸异戊酯溶液，备用；(2)、洁净培养皿中铺放适当大小干净滤纸一张，盛双蒸水达3/4左右体积，用镊子放洁净铜网于滤纸上，待水面平静后，于水面轻轻滴入一滴2％火棉胶醋酸异戊酯液，静置5分钟使其成膜，用洗耳球从皿边缘吸去双蒸水，50-60℃条件下烘干备用；3)、电子显微学样品制备，包括：(1)、按下表配制铺展液(上相液) 试剂 保温样品 2M 醋酸铵 (NH4Ac) 0.1M 乙二氨四 乙酸二钠 (EDTA) 5×10-2％ 月桂酰肌 苷酸钠 (SLS) 0.3mg/ml 细胞色素C (Cyto C) 双蒸水 总体积 加入量 11ul 12.5ul 5ul 10ul 9ul 2.5ul 50ul 终浓度 步骤1所得 DNA 分子 0.8-1ug/ml 0.5M 0.01M 1×10-2％ 50ug/ml 加入顺序 ————————————————————→毕后，用微量进样器针头轻微拌动约100圈；(2)、按下表配制下相液 样品 加入量(ml) 磷酸氢二钠(0.1毫摩尔/升) 13.40 磷酸二氢钾(0.1毫摩尔/升) 3.75 25％戊二醛 3.00 双蒸水 5.25(3)、基因组铺展取洁净载玻片一张，斜放于Teflon皿中，倾下相液于Teflon皿内。用Teflon棒于下相液液面趋赶污物，之后，轻轻抖下少量滑石粉，待滑石粉散开后，用微量进样器吸取适量上相液于载玻片斜面上小心均匀排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的边缘呈现出光亮单层膜区约10秒钟后用镊子夹住覆有火棉胶膜的铜网捞片，得到未经染色的电子显微学样品；(4)、样品染色将未经染色的电子显微学样品用90％乙醇脱水约10秒钟后转入5×10-5％摩尔/升浓度的醋酸双氧铀(UAc)中染色30分钟左右，之后转入90％乙醇中清洗约1秒钟，吸干滤纸后得到最终的电子显微学样品。