[发明专利]中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法

摘要

本发明涉及一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，属于一种经济动物的输卵管分泌细胞体外培养方法。包括下列步骤：输卵管分泌细胞的培养基的制备：包括基础培养基、条件培养基；输卵管分泌原代细胞的获取：输卵管分泌原代细胞的培养：输卵管分泌细胞的传代培养。本发明的有益效果是针对中国林蛙输卵管的特殊药用价值和广泛的应用前景，确定了林蛙输卵管分泌细胞体外培养的条件培养基，实现了林蛙输卵管分泌细胞的体外的原代培养和传代培养，利用细胞工程等生物技术方法，在体外培养具有独特生物功能林蛙输卵管分泌细胞，能更好地开发、应用及保护中国林蛙的天然资源。

主权项

1、一种中国林蛙输卵管分泌细胞体外培养方法，包括下列步骤：一、输卵管分泌细胞的培养基的制备：包括基础培养基、条件培养基；选择适合中国林蛙输卵管分泌细胞的基础培养基有DMEM/Ham’sF12、F10/DMEM或RPMI1640，将上述培养基每份定溶于1000ml四馏水中，再补加抗生素其中青霉素10万单位/L、链霉素100mg/L，培养基用0.22μm滤膜滤过除菌，调整pH为7.4-7.6备用；条件培养基，包括作为营养物质的新生牛血清和添加的促生长类激素，其中新生牛血清为每100mL上述基础培养基中加入5～15ml，胰岛素为5～10mg/L基础培养基；10-6mol/L的雌二醇为5～10μl/ml基础培养基；二、输卵管分泌原代细胞的获取：无菌采取输卵管，采用直接剪切法解离细胞，从而减小对细胞的损伤程度且为体外存活提供更好的前提条件；三、输卵管分泌原代细胞的培养：将获取得原代细胞加入含15％新生牛血清培养液制成细胞悬液，经台盼蓝染色行细胞计数，调整细胞浓度为2×105～5×105个/ml接种于6孔培养皿中，每孔加入细胞悬液3ml，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3～4天换一次培养液；四、输卵管分泌细胞的传代培养：待原代细胞长满单层后，即可进行传代，吸去培养皿中原培养液，用基础培养液洗涤细胞1-2次，洗去残留的血清成分，加0.125％或0.25％胰蛋白酶2ml或0.02％乙二胺四乙酸二钠3ml，放入37℃温箱中消化5-10分钟，倒置显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆即可吸去消化酶液，加入含15％血清终止液终止消化，弃终止液，加入基础培养液，吹打制成细胞悬液，调节细胞数为105～2×105个/ml接种于新培养皿中，完成一次传代。