[发明专利]猪凝血酶的制备方法

摘要

本发明公开一种猪凝血酶的制备方法；材料是猪血与猪脑；制备包括：(1)猪血浆的制备；(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备；(3)猪凝血酶的制备。本发明的猪FV的收率高于Michael、Katzmann和Pryzdial报道的牛FV的收率；猪FXa的收率高于Joseph、Kalafatis、Robert等人报道的牛FXa的收率，本工艺简单、纯化步骤少；利于大规模化生产。经济价值可观。

主权项

1.一种猪凝血酶的制备方法；工艺过程为：材料是猪血与猪脑；试剂：牛血清白蛋白(BSA)；纤维蛋白原(Fibrinogen)；DEAE-纤维素(DEAE-cellulose)；凝血酶活性测定试剂盒；和通用的生化试剂或分析纯试剂；试剂、溶液按照生物化学与分子生物学相关说明书配制；(1)猪血浆的制备向收集新鲜猪血中按1∶9比例加入3.8％的柠檬酸钠抗凝剂和一定浓度的抑制剂；4℃下，4000r/min离心30min沉降红细胞，吸出血浆，置-20℃冻存备用；(2)猪凝血酶原活酶复合物的制备(2.1)猪凝血因子V(F)的制备采用聚乙二醇(PEG)沉淀、柠檬酸钡吸附、DEAE-纤维素离子交换层析方法制备；(2.2)猪激活凝血因子X(Fxa)的制备采用柠檬酸钡吸附、(乙二胺四乙酸二钠盐)EDTA解吸附、硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析、胰蛋白酶激活方法制备；(2.3)猪脑磷脂的制备取猪脑，除去脑膜和血块，称取10g，匀浆，加入3倍量丙酮于4□浸泡24h，滤渣干燥；再加入3倍量乙醚于4□浸泡24h，合并滤液回收乙醚，浓缩物再以丙酮洗涤2～3次，得猪脑总磷脂；总磷脂中加入少量95％热乙醇，4□浸泡24h，收集沉淀，即为猪脑磷脂；(3)猪凝血酶的制备(3.1)猪凝血酶原的制备取新鲜血浆100mL，用蒸馏水稀释10倍，用1％醋酸调pH5.0使蛋白质等电沉淀；静置过夜，然后置于离心机中，以3000r/min离心15min；弃上清取沉淀用20mL 0.9％氯化钠溶解，再置于离心机中以3000r/min离心15min，上清液即为凝血酶原粗品；(3.2)猪凝血酶原的激活采用猪凝血酶原活酶复合物(FV、FXa、猪脑磷脂、Ca2+体系)激活猪凝血酶原，获得猪凝血酶。