[发明专利]人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法

摘要

本发明公开了一种人胎儿胰腺干细胞系及其建立方法，人胎儿胰腺上皮样干细胞来源于正常流产胎儿胰腺组织，体外培养能无限克隆，且具有多向分化潜能；经形态特征、生长特性、免疫组化特征、RT－PCR特征、定向诱导分化特征、染色体核型、DNA序列测定及分析，证明该胎儿胰腺干细胞是人源性胎儿胰腺干细胞；本发明可为研究哺乳动物胰腺发育、糖尿病的产生以及再造胰岛微小器官治疗糖尿病提供丰富的种子细胞，为建立人和哺乳动物胰腺干细胞系提供了一种有效可靠的方法。

主权项

1.人胎儿胰腺干细胞系，其特征在于，人胎儿胰腺上皮样干细胞来源于正常流产胎儿胰腺组织，体外培养能无限克隆，且具有多向分化潜能；具体包括：1)形态特征H.E染色，人胎儿胰腺干细胞完全贴壁后呈多角形上皮样，核多为圆形；Giemsa染色，为单核仁、双核仁或多核仁细胞；电镜，细胞核质比大，胞质无分泌颗粒，线粒体、内质网等细胞器均不发达，属发育早期胰腺细胞；2)生长特性细胞数较少时，可见典型的单克隆生长方式；当细胞生长至75％融合时，呈铺路石样；在该培养条件下，细胞接种1～2d生长缓慢，3～5d为细胞数倍增期；从细胞生长曲线及1年以上细胞扩增生长情况看，该细胞系为永生化人胎儿胰腺干细胞系；3)免疫组化特征人胎儿胰腺干细胞表达核增殖抗原、胰肠同源域1、胰高血糖素、胰岛素、角蛋白19及巢蛋白，不表达分化抗原CD34、CD44及CD45，从蛋白表达水平证实人胎儿胰腺干细胞具有分化为胰岛、上皮及神经细胞多潜能性；4)RT-PCR特征人胎儿胰腺干细胞转录表达胰肠同源域1、胰高血糖素及巢蛋白，从分子转录水平证实该细胞确是胰腺干细胞；5)定向诱导分化特征定向诱导人胎儿胰腺干细胞可分化为双硫腙染色阳性，且分泌胰岛素和胰高血糖素的功能性胰岛细胞团；6)染色体核型传至47代的人胎儿胰腺干细胞染色体数目为2n＝46，其中，中部着丝粒染色体有5对，臂比值为1.33±0.02～1.07±0.03；亚中部着丝粒染色体有7对，臂比值为3.18±0.03～1.45±0.07；端部着丝粒染色体有6对，小染色体有4对，性染色体1对；染色体核型正常；7)DNA序列测定及分析提取人胎儿胰腺干细胞总DNA，进行线粒体DNA D-loop的PCR扩增、测序；采用Clustal W 1.82软件对所测的人胎儿胰腺干细胞与正常人细胞的线粒体DNA D-loop区序列进行同源序列比对分析，同源性为98％；证明该胎儿胰腺干细胞是人源性胎儿胰腺干细胞。