[发明专利]一种制备D－氨基酸氧化酶的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种制备黄素酶D－氨基酸氧化酶的方法。具体涉及，通过构建重组工程菌株获得高效生产突变D－氨基酸氧化酶的方法。本发明通过基因工程手段改造来源于三角酵母Trigonopsisv viabllis的野生型D－氨基酸氧化酶，将一段Histag融合于野生型酶的N末端和C末端，进而通过亲和层析实现突变酶的高效快速分离。酶在发酵液中的表达水平为4000IU/mL，高于野生型酶，Ni柱亲和层析的回收率为50％。纯化的酶可用于高效氧化转化头孢菌素C－产生戊二酰－7－ACA，与GL－7－ACA酰化酶联用可生产7－ACA。

主权项

1，一种制备D-氨基酸氧化酶的方法，其特征是将D-氨基酸氧化酶基因修饰后转化甲醇酵母宿主菌，实现突变酶高效表达，用亲和层析分离纯化高纯度D-氨基酸氧化酶，包括下述步骤，1)突变D-氨基酸氧化酶基因，以质粒pPIC3.5K-DAAO为模板，在DAAO编码序列的5’端和3’端导入连续编码6个组氨酸的Histag序列，获突变基因；2)构建突变酶表达菌株，步骤1)的突变基因平端克隆到pBluescript(SK+)，经Not I和BamH I酶切后克隆到载体pPIC3.5K，得重组质粒pPIC3.5K-hisDAAO，所述重组质粒用Sal I线性化，电转化毕赤酵母宿主细胞，PCR法、酶活力测定筛选阳性重组菌株Fudan0112，2004年3月3日保藏于CGMCC，保藏编号：CGMCC No.1103；3)发酵、培养、分离突变D-氨基酸氧化酶，步骤2)的菌株发酵、培养，超声破壁菌体、低温离心得上清作为粗酶液，再经Ni柱进行亲和层析，梯度洗脱。