[发明专利]中国汉族人血管内皮生长因子基因重组、表达、纯化及其医学应用

摘要

本发明涉及一种人血管内皮生长因子(VEGF)基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及VEGF蛋白及其类似物、衍生物在肝癌临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的中国汉族人肝癌组织RNA，用PCR方法获得人VEGF基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取VEGF蛋白，进而应用亲和层析方法得到高纯度的蛋白，为临床进一步观察肿瘤病人体内VEGF水平的变化，奠定了物质基础。

主权项

1、一种表达纯化人VEGF基因和重组VEGF的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)克隆人VEGF的基因，用反转录PCR法扩增VEGF的基因；(2)将上述扩增的VEGF基因与克隆载体连接，构建人VEGF克隆质粒；(3)将上述人VEGF克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)表达人VEGFa、将上述带有人VEGF基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，接种LB培养基培养瓶内，在37℃摇箱内培养，测菌液A650OD值为0.6-0.8时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)纯化人VEGF蛋白。a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、超声裂解细菌，离心，将沉淀加8M尿素悬浮，离心，取上清液；c、纯化人用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。