[发明专利]转基因家蚕打靶载体的构建方法

摘要

本发明公开了转基因家蚕打靶载体的构建方法，该方法的步骤包括根据家蚕丝素轻链基因序列，设计0.5kb和5kb基因片段PCR扩增的专用引物；将丝素轻链基因0.5kb和5kb基因片段以TaqDNA聚合酶进行PCR扩增；然后将0.5kb与pBlueselect质粒经XhoI和ApaI双酶切后以T4DNA连接酶连接成pBs－FS中间质粒；5kb与pBs－FS经BamHI和XbaI双酶切后以T4DNA连接酶连接成pBs－FS－FL中间质粒；构建带有目的基因GFP的质粒pUCGFP；再将pBs－FS－FL与pUCGFP经PstI和BamI双酶切后以T4DNA连接酶连接构建成转基因蚕丝腺生物反应器基因打靶载体pBs－FS－GFP－FL。本发明方法简便、廉价并具有较高的目的基因导入率。

主权项

1.转基因家蚕打靶载体的构建方法，包括以下步骤：1)设计引物a)根据家蚕丝素轻链基因序列，设计0.5kb和5kb基因片段PCR扩增的专用引物：b)5kb基因片段PCR扩增两段专用引物设计时分别引入XbaI和BamHI酶切位点，0.5kb基因片段专用引物设计时分别引入ApaI和XhoI酶切位点；2)丝素轻链基因0.5kb和5kb基因片段以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增；3)0.5kb与pBlueselect质粒经Xho I和Apa I双酶切后以T4 DNA连接酶连接成pBs-FS中间质粒；4)5kb与pBs-FS经BamHI和XbaI双酶切后以T4 DNA连接酶连接成pBs-FS-FL中间质粒；5)带有目的基因GFP的质粒pUCGFP构建；6)pBs-FS-FL与pUCGFP经PstI和BamI双酶切后以T4 DNA连接酶连接构建成转基因蚕丝腺生物反应器基因打靶载体pBs-FS-GFP-FL。