[发明专利]制备强荧光藻蓝蛋白的方法

摘要

本发明制备强荧光藻蓝蛋白的方法是以新鲜藻泥为原料，用含EDTA的磷酸缓冲液洗涤，经超声波破碎细胞，释放出色素蛋白，通过离心分离，去除不溶性细胞膜及细胞器。收集上清液，经分级盐析，收集藻蓝蛋白沉淀。沉淀溶于含EDTA的磷酸缓冲液中，通过Sephadex G-25脱盐，上DEAE-Sepharose FF柱，去掉碱性杂质蛋白，然后上羟基磷灰石柱，获得藻蓝蛋白洗脱液。接着上CM-Sepharose FF柱，去掉酸性杂质蛋白。最后再上第二次羟基磷灰石，获得高纯度强荧光的藻蓝蛋白。本发明既省力又省时，适合工业化大规模生产。

主权项

1.制备强荧光藻蓝蛋白的方法，其特征是控制温度在0～4℃下，包括以下 步骤： 1)新鲜藻泥加入pH值7.0-7.6、浓度50mmol/L、含0.1～0.5mmol/LEDTA 的磷酸缓冲液，冰浴超声波破，将破碎液离心后去沉淀，收集上清液； 2)分级盐析上清液，量取上清液体积，按30％饱和(NH₄)₂SO₄计算用量， 缓慢加入上清液中，加毕后静置8～12小时，离心、取上清，上清液再缓慢加 至55％饱和度(NH₄)₂SO₄，静置10小时以上，离心、留沉淀备用； 3)沉淀物用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓 冲液溶解，上SephadexG-25柱脱盐，用10mmol/L、pH值7.0～7.6、含0.1mmol/L 的EDTA的磷酸缓冲液洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分； 4)脱盐后的荧光藻蓝蛋白上预先用10mmol/L，pH值7.0～7.6、含 0.1mmol/L的EDTA的磷酸缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF柱，用含0～ 0.5mol/LNaCl的10mmol/L、pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液作线性梯度洗脱，流 速控制在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋白部分； 5)将步骤4)收集的荧光藻蓝蛋白部分上羟基磷灰石柱，用pH值7.0～7.6、 浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的荧光 藻蓝蛋白部分； 6)将步骤5)收集液再上CM-SepharoseFF柱，用pH值5～6、浓度10～ 200mmol/L的乙酸缓冲液作梯度洗脱，收集荧光藻蓝蛋白部分； 7)将步骤6)收集的荧光藻蓝蛋白部分再上羟基磷灰石柱，以pH值7.0～ 7.6、浓度10～100mmol/L的磷酸缓冲液作梯度洗脱，收集吸收峰在620nm处的 荧光藻蓝蛋白部分； 8)将步骤7)收集的荧光藻蓝蛋白部分上SephadexG-100柱，用10mmol/L、 pH值7.0～7.6的磷酸缓冲液洗脱，控制流速在5～10ml/min，收集荧光藻蓝蛋 白部分，经A620/280双波长检测，将色价比达4.5以上的荧光藻蓝蛋白液用聚 乙二醇20000浓缩，浓缩液经冷冻、干燥，得本发明强荧光藻蓝蛋白。