[发明专利]分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法

摘要

本方法采用琼脂糖凝胶偶联p－氨基苯甲脒配基制备亲和层析柱，从蚯蚓的匀浆液中分离纯化出具有较强纤溶活力的单组分蛋白酶。通过该亲和层析柱，用含有脲基及胍基的化合物制备洗脱液进行梯度洗脱，经透析或分子筛等方法脱盐，得到其中的EFE－III纤溶蛋白酶，它具有很强的纤维蛋白溶解活力。用该方法纯化来源于各种蚯蚓的纤溶蛋白酶具有简洁方便，成本低等特点，适用于实验室和规模化生产。

主权项

1.一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于以p-氨基苯甲脒为配基，包括以下步骤：1)用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖填料：a.用羰基二咪唑活化琼脂糖填料：在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；用浓度递增的二氧六环逐渐转入有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中；b.用常规的溴化氰方法活化琼脂糖填料；2)采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基：将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐溶解在NaHCO3溶液中，然后与活化后的琼脂糖填料按体积比1∶10～1∶5混合，于室温下振荡偶联，使配基连接到琼脂糖填料上，反应结束后，将填料抽干，充分洗涤，再用Tris-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液交替洗涤2次以上，抽干，待用；3)用平衡缓冲液装柱，充分平衡；4)蚯蚓粗提物上样；5)非特异性洗脱采用平衡缓冲液，洗脱至基线；特异性洗脱是用包括0.01～3.0M的含有脲基或胍基化合物的平衡液作为特异性洗脱液，来进行特异性梯度洗脱；收集特异性梯度洗脱下来的单组分蚯蚓纤溶酶；6)除去洗脱下来的蛋白酶溶液中的盐；7)采用通常的工艺浓缩得到蚯蚓纤溶酶中的EFE-III组分。