[发明专利]用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法

摘要

用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法，是以蚕卵或蚁蚕为材料，以每一品种的亲本和杂交种为一个组合，分别快速提取DNA模板，与适当的DNA合成引物构成反应体系，扩增特异性的DNA片断，建立每一品种的亲本和杂交种的特征性DNA片段电泳参照图谱，作为杂交率鉴别的依据。再抽取100～1000粒的蚕卵或蚁蚕构成样本，用上述方法建立每一个体的DNA片段电泳图谱，并与参照图谱比较，判断是否是杂交种子，算出样本的杂交率。用数理统计的原理算出由样本杂交率推断总体杂交率的正确性，并设定其为95～99％。

主权项

1.用DNA指纹判别家蚕杂交率的鉴定方法，其特征在于它的方法是：(1)DNA模板的提取第一步：取1粒蚕卵或1条蚁蚕，加入10～100μl0.1～1.0mol/LNaOH，0.5～2.5％ME缓冲液，冰浴研磨10～30min，加50～200μl50～200mmol/LTris-HClpH6～9缓冲液，搅拌10min，10000～15000×g、4℃离心5～20min；第二步：取上清液10～100μl，加2.5倍99％酒精，-20℃中放置15～60min，10000～15000×g、4℃离心5～30min，用10～100μl无菌去离子水溶解，即得到PCR反应所需的DNA模板；(2)PCR反应的引物如下随机引物，可在目前生产用蚕品种的亲本与杂交种之间形成特征性的谱带，用于杂交率的鉴定引物名引物序列ZHD0001CGGCACTGAGGAZHD0002CAGGTCTTGGGZHD0003GGGCACTGAGGTZHD0004TGGATGAGACCZHD0005TGTAACCAGCCZHD0006GTGGCGTCCTTZHD0007TGGCACTGAGGAZHD0008GTGCCCAGCCTZHD0009GATCTGACTGTZHD0010GGGCACTGAGGAZHD0011AGGCACTGAGGGZHD0012CGGCACTGAGGGZHD0013AGTGCCTAACCZHD0014TGGCACTGAGGTZHD0015AAGGTCTTGGGZHD0016GGGCACTGAGGCZHD0017GAAAGTGCGGCZHD0018AGGAGGAGAGGZHD0019CGGCACTGAGGCZHD0020TAGGTCTTGGGZHD0021TGGCACTGAGGGZHD0022CGAAGCCAGCCZHD0023AGGCACTGAGGCZHD0024ACAGTGCCGGTZHD0025GGGCACTGAGGGZHD0026CGGCACTGAGGTZHD0027GACGTAGCGTCZHD0028TGGCACTGAGGCZHD0029GCAGCACTGACZHD0030ACAGTGCTGTGZHD0031AGGTCTTGGGTZHD0032AGGCACTGAGGAZHD0033TGTCAGGGCAAZHD0034GTGGAGAGCAGZHD0035ATAGACTGACATCAZHD0036AGGCACTGAGGTZHD0037CACCACTCCGAZHD0038GAGGTCTTGGG(3)PCR反应条件PCR反应体系：上述抽提得到的DNA模板液1～5μl；TaqDNA聚合酶0.2～5u；按总体积1/10的量加入10倍PCR反应缓冲液，组成成分：100mM/LTris-HCl，100mM/LKCl，80mM/L(NH4)2SO4，20mM/LMgCl2，0.5％NP-40pH9.0；dNTP各0.15～0.25mmol/L；加上述DNA合成引物，使终浓度为0.1～1.5μmol/L；加无菌去离子水，使总体积达到10～100μl；PCR反应条件：94～95℃预热4～5min；变性解链：94℃0.5～2min；复性：30～50℃0.5～2min；合成延伸：70～75℃1～5min；循环：30～45次；保存：70～75℃，5～10min；4℃，0.5～12h；反应设备：PCR反应仪；(4)DNA电泳采用0.8～1.5％琼脂糖凝胶，电泳缓冲液用0.5～1％TAE或TBE；(5)电泳谱带采用上述DNA模板提取方法、PCR反应引物、PCR反应条件、DNA电泳条件，对生产上常用的每1个品种的亲本和杂交种构成的组合进行PCR反应和DNA电泳，获得相应的特征性DNA片段电泳图谱，该图谱的特征是2个亲本之间的电泳谱带具有明显的、可资鉴别的不同之处，其杂交种拥有这2个亲本所有特征性的电泳谱带，可明确证明该杂交种来源于这2个亲本；(6)样本容量取100～1000粒蚕卵或蚁蚕作为样本，供杂交率鉴定用，用样本的结果推断总体的结果，正确率可达到95～99％。