[发明专利]端粒酶活性的定量测定方法

摘要

一种端粒酶活性的定量测定方法，包括含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备；端粒酶介导的引物延伸反应；PCR扩增反应产物以及通过DNA荧光染料染色来进行的结果分析。本发明还具有下列优点：无放射性玷污，端粒酶的定量测定的步骤更简化，实验周期更短，重复性更好。在灵敏性方面和在避免Taq DNA聚合酶抑制剂所引起的假阴性及引物二聚体引起的假阳性方面同Kim放射性定量法相比也相当。

主权项

1.一种端粒酶活性的定量测定方法，包括下列步骤：含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备；端粒酶介导的端粒重复序列的延伸；PCR扩增端粒酶作用产物；扩增结果的分析和利用计算公式进行定量分析，其特征在于在含端粒酶的S-100细胞抽提液的制备步骤中，直接取待抽提细胞用磷酸盐缓冲液洗一次；在端粒酶介导的端粒重复序列的延伸步骤中，在TRAP缓冲液中加入无放射性的TS[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’]引物；在PCR扩增端粒酶作用产物的步骤中，加入反向引物、内标引物和Taq DNA聚合酶，其中反向引物为：ACX[5’-GCGCGG[CTTACC]3CTAACC-3’]，内标引物为：NT[5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’]和TSNT[5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’]；在扩增结果的分析步骤中，电泳结果采用荧光染料染色；在利用计算公式进行定量分析步骤中，利用公式TPG＝{[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]}，其中：TP为待定量的细胞提取液所得条带灰度，TI为待定量的细胞提取液的内部参照所得条带灰度，R8为定量参照所得条带灰度(反应体系中的量为0.1amol时为标准)，B为只加裂解液所得条带灰度，RI为R8的内部参照所得的条带灰度。