[发明专利]体内生产头孢菌素的改良

权利要求书

1．编码扩环酶的分离的DNA片段，其中所述DNA片段在宿主产黄青霉中表达后，该扩环酶主要存在于所述宿主的胞质溶胶中。

2．根据权利要求1的DNA片段，其中编码C末端微体导向信号的核苷酸序列已被修饰。

3．根据权利要求2的DNA片段，其中已经修饰了编码C末端三肽序列X1-X2-X3的核苷酸序列以充分防止宿主细胞中表达的扩环酶定位于宿主细胞的微体中，其中X1是一个选自丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸的残基，X2是一个选自赖氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸残基，而X3是亮氨酸或丙氨酸。

4．根据权利要求3的DNA片段，其中所述DNA片段可获自带小棒链霉菌。

5．根据权利要求4的DNA片段，其中编码C末端三肽序列丝氨酸-赖氨酸-丙氨酸的核苷酸序列已被修饰以充分防止宿主细胞中表达的扩环酶定位于宿主细胞的微体中。

6．根据权利要求5的DNA片段，其中编码C末端三肽序列丝氨酸-赖氨酸-丙氨酸的核苷酸序列已被修饰成编码三肽序列丝氨酸-赖氨酸-天冬氨酸的核苷酸序列。

7．根据以上权利要求的任意一项的DNA片段，其还包含所述DNA在宿主细胞中表达的调节区。

8．根据权利要求7的DNA片段，其中所述宿主细胞选自微生物如酵母或真菌。

9．根据权利要求8的DNA片段，其中所述宿主细胞是产黄青霉。

10．通过转化，任选为祖细胞的转化，包含可表达形式的根据权利要求1-9之任一项的DNA片段的宿主细胞。

11．根据权利要求10的宿主细胞，其选自微生物，优选选自产黄青霉、构巢曲霉、黑曲霉和Acremonium chrysogenum的真菌。

12．根据权利要求11的宿主细胞，其中宿主是产黄青霉的菌株。

13．含有主要定位于胞质溶胶的功能性扩环酶的根据权利要求10-12之任一项的宿主细胞。

14．包含根据权利要求10-13之任一项的细胞的培养物。

15．制备根据权利要求10-13之任一项的宿主细胞的方法，其包括步骤：在所述宿主的转化条件下用根据权利要求1-9之任一项的DNA接触所述宿主细胞，并选择获得所述DNA的细胞。

16．根据权利要求15的制备宿主细胞的方法，其还包括选择扩环酶主要定位于胞质溶胶的细胞。

17．根据权利要求16的方法，其中所述宿主细胞是产黄青霉细胞。

18．扩展β-内酰胺化合物的五元环形成六元头孢烯化合物的方法，其包括步骤：将能产生所述β-内酰胺化合物的宿主在其有利条件下生长，并使所述宿主从编码异源扩环酶的DNA片段表达该能扩展所述β-内酰胺化合物的五元环的异源扩环酶，以便形成所述六元头孢烯化合物，其特征在于所述扩环酶是从编码主要定位于宿主细胞的胞质溶胶中的扩环酶的DNA片段表达的。

19．根据权利要求18的方法，其中所述扩环酶之所以主要定位于胞质溶胶，是由于其编码DNA片段已被修饰，从而改变了微体导向信号。

20．根据权利要求18或19的方法，其中编码所述扩环酶的DNA片段可获自带小棒链霉菌。

21．根据权利要求18-20之任一项的方法，其中宿主是产黄青霉。

22．根据权利要求18-22之任一项的方法，其中β-内酰胺化合物选自苯乙酰基-6-APA、苯氧乙酰基-6-APA、α-氨基己二酰基-6-APA、己二酰基-6-APA、戊二酰基-6-APA、环庚基-6-APA、庚二酰基-6-APA、或反式-β-氢粘康酰基-6-APA。

23．制备头孢烯化合物的方法，其包括步骤：采用根据权利要求18-23之任一项的方法扩展所述β-内酰胺化合物的penam环，并回收所形成的头孢烯化合物。