[发明专利]用于遗传物质高通量表达的杆状病毒表达系统和方法

说明书

本发明的领域

广义上，本发明涉及分子生物学和遗传学领域。具体地，本发明涉及用于通过转染昆虫细胞表达外源遗传物质的新型杆状病毒表达系统。

本发明的背景

已产生了描述许多较小生物遗传密码的大量序列信息。人们以一种比以前认为可能的快得多的方式在类似地描述高等生物如人类的遗传构成方面取得了巨大成功。毫无疑问，人们会加强努力完成这些生物，尤其是那些对人类重要的生物如植物和其它哺乳动物，的遗传密码的测序工作。现在特别需要开发确定这些序列数据已描述了序列的特定基因和内含子的功能的快速而准确的方法，以便利用这些序列数据。这种努力的第一步是表达已测序遗传物质的基因产物。有效完成这一目标所涉及的关键技术有可能利用能同时处理许多基因或基因产物样品的机器人技术。而且，可采用纯化表达基因产物的最佳方法进一步推动该技术。

杆状病毒感染昆虫细胞。原核细胞和真核细胞均已用于表达外源遗传物质。然而，只有当外源遗传物质的产物不需要翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化或信号肽切除时，原核细胞如大肠杆菌细胞才适合表达其基因产物。原核细胞不含有这种翻译后修饰所需的机构。因此，在真核细胞中开发新型易操作的重组表达系统尤为重要。杆状病毒感染的昆虫细胞可完成大多数真核细胞转录后修饰(包括磷酸化、N-和O-连接糖基化、乙酰化、二硫键交连、寡聚物组装和亚细胞定位)，并且其已被用于从多种外源基因制备功能性重组蛋白。

遗传修饰的杆状病毒被广泛用于制备重组蛋白(Davies，Bio／technology 12：47-50(1994))。典型杆状病毒包括但不限于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、Rachiplusia ou、Galleria mellonella和家蚕(Bombyx mori)。其中，可能苜蓿银纹夜蛾表征最全面且应用最广泛。在天然的病毒生活周期中杆状病毒的多角体蛋白以非常高的水平表达，而在细胞培养中又不是必需的。这就允许将其替换为几乎任何感兴趣的异源核苷酸序列。任何插入以替换多角体蛋白的异源核苷酸本身可由多角体蛋白启动子控制，并由此获得同样高水平的表达。

杆状病毒基因组包含大约130kb DNA，对于常规质粒克隆技术来说太大而不易操作，因此对其进行分子水平的操作是具有挑战性的。传统解决该问题的方法是通过同源重组导入同时含有外源基因、合适启动子和终止序列的盒子。这通过在质粒载体上以病毒DNA序列从两侧包围该盒子来完成，该病毒DNA序列是待插入的病毒基因组位点的两侧序列。该方法的效率不到1％。

在过去采用噬菌斑纯化由此产生克隆载体。一些传统程序参见Smith等，美国专利4，745，051；Smith等，美国专利4，879，236；Summers等，美国专利5，169，784；Guarino等，美国专利5，077，214；Kang等，美国专利5，194，376；Matsuura等，美国专利5，229，293和Murphy等，美国专利5，516，657，这些专利的公开以参考文献并入本文。然而最近已发展了几种不同技术增加重组至杆状病毒基因组的效率。下面描述那些最成功的方法。

杆状病毒基因组已被重新构建成在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中增殖的复制子。这通过在杆状病毒基因组多角体蛋白位点插入一个酵母自主复制序列(ARS)，以及CEN(中心粒)序列(它作为有丝分裂着丝粒而确保病毒基因组以稳定的低拷贝数分离)和URA3筛选标记(以允许在无尿嘧啶培养基中生长)来实现。这样多角体蛋白启动子启动的外源基因的重组可被酵母接受，所产生的杆状病毒基因组可从酵母细胞中提取，并作为克隆载体直接转染至昆虫细胞中。该方法的优点包括接近100％的效率并能在外源宿主中操作那些其产物可能对昆虫细胞有毒的基因。然而，需要大量操作，使该方法繁重而复杂。