[发明专利]抗肿瘤灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制备方法

说明书

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的糖蛋白复合物、该复合物的用途及其制备方法。

最近的研究表明，植物多糖及其复合物对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓、肺炎等都具有显著的疗效。大量药理和临床研究表明，该多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，而且对正常细胞没有毒副作用。

近年来，国内外的大量研究表明灵芝中具有抗肿瘤活性的主要有效成分是灵芝多糖。Mizuno等人(Nippon Nogeikagaku Kaishi 58，871，1984；59，1143，1985)及Sone等人(Agric.Biol.Chem.49，2641，1985)均报道灵芝子实体水溶性多糖具有明显的抗肿瘤活性。然而，由于灵芝人工栽培较为困难，周期较长，使得由子实体制得的灵芝多糖价格昂贵，难以推广。

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物及其用途和制备方法，该方法是利用生物工程发酵技术培养灵芝菌丝体，并从中提取出具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白，并弄清楚它的一级和二级结构，所用方法简单易行、成本低廉。这种复合物可用于生产保健产品或进一步开发出新的天然药物。

为实现本发明的上述目的所采取的技术措施是：

一种具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物，该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为13％，其重均分子量为6.46×105，在镉乙二胺水溶液(镉乙二胺饱和水溶液按1∶1的体积比与水混合)中为较伸展的无规线团构象，特性粘度[η]和均方根旋转半径<S2>1/2的分子量依赖关系分别为[η]=5.1×10^-2M_w^0.60和<S²>^1/2=3.9×10^-2M_w^0.50。

该糖蛋白复合物对植入小鼠(昆明种小白鼠)体内的爱氏腹水肿瘤抑制率的结果见附表1。显然，菌丝体糖蛋白的抗肿瘤活性明显高于子实体水溶性多糖，因此，该复合物可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保建品，具有极大的推广和应用前景。

一种制备上述具有抗肿瘤活性的灵芝菌丝体糖蛋白复合物的方法：

本发明采用灵芝菌种(购自华中农业大学食用菌基地)经液体培养后得到灵芝菌丝体，将此灵芝菌丝体分别用乙酸乙酯和甲醇回流后，用90％乙醇浸泡过夜，匀浆后离心，除去上清液，残渣用0.25M磷酸盐缓冲液(PBS)于70-90℃下提取，离心，收集提取液。提取液浓缩后，用Sevag法除去游离的蛋白质，重复多次，然后分别用清水和二次蒸馏水透析7-10天和3-5天。最后加入丙酮，沉淀出糖蛋白复合物。过滤分离出该糖蛋白复合物，并用无水丙酮洗涤，真空干燥得到白色粉状固体产品。所得菌丝体的产率为每升培养基60克。

用红外、核磁共振、高效液相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确定了其化学组成和二级结构。该糖蛋白复合物中多糖为葡聚糖，蛋白质含量为13％。其重均分子量为6.46×10⁵，在镉乙二胺水溶液中为较伸展的无规线团构象。它的特性粘度[η]和均方根旋转半径<S²>^1/2的分子量依赖关系分别为[η]=5.1×10^-2M_w^0.60和<S²>^1/2=3.9×10^-2M_w^0.50。

本发明所用的灵芝菌丝体菌种购自华中农业大学，深层发酵液体培养基是以农副产品麸皮的提取液为主要原料，培养基的组成如下：

麸皮提取液    93％

葡萄糖        5％

酵母提取物    1％

蛋白胨        1％

KH₂PO₄    0.05％

K₂HPO₄    0.05％

MgSO₄·7H₂O0.05％。

与已有技术相比较，本发明科技含量高，且有明显的技术进步：