[发明专利]用于逆转录病毒载体的悬浮包装细胞系

说明书

本发明涉及用于逆转录病毒载体的悬浮包装细胞系及其在生产感染性的无复制能力的逆转录病毒载体方面的应用。

病毒由编码病毒基因的基因组和病毒衣壳组成，在逆转录病毒中衣壳可由一些被膜包围。

识别逆转录病毒要区分顺式元件5′-LTR、3′-LTR、包装序列Psi、正链引物结合位点与负链引物结合位点，以及反式元件gag(衣壳蛋白)、pol(反转录酶)和env(被膜蛋白)。反式元件可由病毒基因组上的外源基因代替；然而这样的病毒将依赖于称为辅助病毒的病毒，这种辅助病毒既可以是完整的具感染性的病毒，也可以是非感染性的例如无包装序列的病毒。包含这种非感染性的辅助病毒和/或一种或多种辅助病毒的辅助基因的细胞，称之为包装细胞系，其中辅助病毒基因可为瞬时表达的、游离的或整合到基因组中的基因。因此，包装细胞系并不释放有复制能力的感染性的病毒颗粒。如果辅助基因来自不同的辅助病毒，那么所形成的载体可称作嵌合逆转录病毒载体；这个过程称为假型(pseudoty ping)。通常使用的这种嵌合包装系统有例如携带亲嗜性MoMuLv病毒的gag-pol基因和兼嗜性4070Ampho病毒的env基因的GP+env Am12(Markowwitz，D.G等，Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218)。甚至可能在包装细胞系中出现来自几种病毒(甚至带有遗传修饰的env基因)的env基因混合物。

包装细胞系也可以包含不完整的分节段形式的病毒辅助基因组，这种情况下可称为含割裂病毒基因组的包装细胞系，这种变异具有更大的安全性来抵抗通过重组事件不期望地释放具有感染性和复制能力的病毒。

然而，如果包装细胞系经除顺式元件外还携带外源基因的逆转录病毒载体转染或转导，那么这些病毒基因组便可作为具感染性但无复制能力的逆转录病毒载体被包装和释放。这种细胞系可称为逆转录病毒生产细胞系。

所有过去制备的逆转录病毒包装细胞系都是以贴壁细胞即贴于表面生长的细胞为基础的：

基于贴壁细胞NIH3T3的包装细胞系GP+E86和GP+envAm12可见Markowitz.D.G.等在Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218中的描述。Miller，A.D.等在分子细胞生物学(Mol.and cell Biol.)，6(1986)2895-2902中描述了基于贴壁细胞NIH3T3的包装细胞系PA317。Miller，A.D.等在病毒学杂志(J.Virol.)，65(1991)2220-2224中描述了基于NIH3T3细胞的GALV包装细胞系PG13。Danos，O.等在美国国家科学院院报(PNAS USA)，85(1988)6460-6464中描述了基于NIH-3T3细胞的包装细胞系ΨCre和ΨCrip。

Rigg，R.J.等在病毒学(Virology)218(1996)290-295中描述了基于一种人细胞系的包装细胞系Propack-A。Cosset，F.-L.等在病毒学杂志，69(1995)7430-7436中描述了基于一种人纤维瘤细胞系(HT1080)的包装细胞系FLY A13和FLY RD18。基于D17和其它狗贴壁细胞系的包装细胞系可见WO92/05266的描述。

通常描述的细胞系大多也是贴壁生长。贴壁细胞系的一个优点在于它容易操作。因而贴壁细胞相对容易克隆，并且可使用病毒尤其是逆转录病毒，即经转染或转导后直接克隆选择细胞是可能的。单个克隆可以容易地通过挑选进行识别、计数并分离。死细胞简单地因脱落而不可能被误认为活细胞，为变换培养基仅仅需要简单地通过吸管除去上清液且加入新鲜培养基。接种和维持细胞通常并不关键，因为贴壁细胞形成细胞克隆，并在组织单元中相互刺激生长。转移细胞时，对于贴壁细胞需要额外的胰蛋白酶处理以分散细胞，但通常并不关键。

悬浮生长的细胞需要一系列不同的方法以进行克隆和转导实验。因而克隆选择需要使用固定添加剂如软琼脂，用称作有限稀释的方法系列稀释细胞，直到理论上每个容器只有一个细胞，或者使用表面标记物或荧光标记物(如GFP)，使得可通过FAC分选器直接选择重组细胞。活细胞和死细胞只能通过染色区分。变换培养基总是需要离心步骤。

过去并不知道悬浮生长的细胞系可作为逆转录病毒的包装细胞系。到目前为止也没有实验描述已建立的贴壁生长的包装细胞系可转变为悬浮生长。