[发明专利]外源基因转化灵芝的方法

说明书

本发明涉及一种利用基因工程技术将外源基因转化入灵芝的方法。

灵芝是一种珍贵的药用和食用真菌，由于其对多种疾病尤其是当今医学上的一些顽症如肝炎、心血管疾病、癌症等具有显著的疗效，因而已引起国际医学界的重视，并已广泛开展了对其生化药理及临床应用等方面的研究。但目前关于灵芝的分子生物学方面的研究报道还很少，迄今尚未有外源基因成功地在灵芝中表达的报道。灵芝是一种大型药用和食用真菌，以它作为基因工程的受体菌，有着与细菌、酵母菌不同的独特优点。它是一种应用前景很广的异源基因表达系统，因此，通过基因工程技术建立稳定的灵芝转化系统，对充分利用和开发灵芝这一珍贵的资源有着重要的意义。

本发明的目的是研究并提供一种利用外源基因转化灵芝的方法，以便建立稳定有效的灵芝外源基因转化体系，从而能够直接有效地获得具有优良遗传性状或重要经济价值的表达产物的转基因灵芝新菌种。

本发明方法是将灵芝菌丝用溶壁酶酶解并制成纯化的灵芝原生质体，然后以含有外源基因(即目的基因，如抗性基因等)的真菌表达质粒为载体，采用PEG介导的转化法，对该纯化的灵芝原生质体进行转化处理，再将处理后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。

本发明方法一般包括以下具体步骤：

(1).取新鲜灵芝湿菌丝，按每克湿菌丝2-10ml酶液的比例加入溶壁酶液，30-35℃酶解1.5-30小时；

(2).将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心(通常为3000-5000r/min 5-10min)去上清液，再用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂洗涤1-3次，得到纯化的灵芝原生质体；

(3).将纯化的灵芝原生质体以1×10⁸个/ml的浓度悬浮于液体再生培养基中，然后取1ml原生质体悬液，离心去掉上清液后，再将原生质体悬浮在200-300μl再生培养基中，并加入所选用的质粒载体5-20μg和PEG缓冲液50-100μl(如果同时加入肝素钠50-100μg，可更有利于提高转化率)，冰浴30-60分钟，再加入0.5-1mlPEG缓冲液，混匀后于25-28℃温育10-30分钟，然后离心沉淀原生质体(通常为3000-5000r/min 5-10min)；

(4).将上述经转化处理的原生质体悬浮于1ml液体再生培养基中，25-28℃静置培养3-5天，再涂布于含有选择因子的再生培养基平板上，25-28℃倒置培养4-8天，即可得到灵芝转化株。

在本发明方法中：

所用的溶壁酶液(简称酶液)的成份及其配比通常为：溶壁酶1-2.5％(w/v)，纤维素酶0.5-2.5％(w/v)，渗透压稳定剂0.5-0.8mol/L。可由1-2.5g溶壁酶和0.5-2.5g纤维素酶溶解于100mL 0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液而成。

所用的渗透压稳定剂通常为硫酸镁或甘露醇。

所用的再生培养基为常规使用的真菌原生质体再生培养基，通常使用的为纤维二糖再生培养基和MYG再生培养基，它们的配方分别为：

纤维二糖液体再生培养基：纤维二糖15克，蛋白胨2克，酵母粉4克，溶于0.5-0.8mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。

MYG液体再生培养基：麦芽糖10克，葡萄糖4克，酵母粉4克，pH自然，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，至总体积为1L。

纤维二糖、MYG固体再生培养基：相应的液体培养基中加入1.5％的琼脂。

所用的质粒载体通常优选pAN7-1真菌表达质粒。该质粒所带的大肠杆菌hph基因上游和下游分别与构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)启动子和色氨酸合成酶C基因(trpC)转录终止序列连接而能在真菌中表达(Peter J.Punt etal.，1987，Gene，56：117-124)。PEG缓冲液各成份的配比为：PEG4000 40-60％(w/v)，CaCl₂ 5-10mmol/L，Tris(pH7.4)5-10mmol/L。

本发明方法中用于制取灵芝原生质体的新鲜灵芝菌丝可通过以下方法培养得到：取PDA斜面上生长旺盛的灵芝菌丝，接种于液体PDA培养基中(PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，加水至1L，pH自然)，25-28℃培养2-4天，然后以3000-5000r/min离心5-10min，去上清液，用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂溶液洗涤1-3次，得到新鲜的灵芝湿菌丝。