[发明专利]外源基因转化灵芝的方法

权利要求书

1.一种外源基因转化灵芝的方法，其特征是将灵芝菌丝用溶壁酶酶解并制成纯化的灵芝原生质体，然后以含有外源基因的真菌表达质粒为载体，采用PEG介导的转化法，对该纯化的灵芝原生质体进行转化处理，再将转化后的灵芝原生质体进行再生培养和选择性培养，从而获得灵芝转化株。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征是包括如下具体步骤：

(1).取新鲜灵芝湿菌丝，按每克湿菌丝2-10ml酶液的比例加入溶壁酶液,30-35℃酶解1.5-3.0小时；

(2).将上述酶解液用G3砂芯漏斗过滤，滤液经离心去上清液，再用0.5-0.8mol/L的渗透压稳定剂洗涤1-3次，得到纯化的灵芝原生质体；

(3).将纯化的灵芝原生质体以1×10⁸个/ml的浓度悬浮于液体再生培养基中，然后取1ml原生质体悬液，离心去掉上清液后，再将原生质体悬浮在200-300μl再生培养基中，并加入所选用的质粒载体5-20μg和PEG缓冲液50-100μl，冰浴30-60分钟，再加入0.5-1ml PEG缓冲液，混匀后于25-28℃温育10-30分钟，然后离心沉淀原生质体；

(4).将上述经转化处理的灵芝原生质体悬浮于1ml液体再生培养基中，25-28℃静置培养3-5天，再涂布于含有选择因子的再生培养基平板上，25-28℃倒置培养4-8天，即可得到灵芝转化株。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征是步骤(3)中在加入质粒载体的同时，加入肝素钠50-100μg。

4.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所用溶壁酶液的成份及其配比为：溶壁酶1-2.5％(w/v)，纤维素酶0.5-2.5％(w/v)，渗透压稳定剂0.5-0.8mol/L。

5.按照权利要求1、2或3所述的方法，其特征是所用的真菌表达质粒为pAN7-1。

6.按照权利要求2或3所述的方法，其特征是所用PEG缓冲液的成份及其配比为：PEG4000 40-60％(w/v)，CaCl₂ 5-10mmol/L，Tris(pH7.4)5-10mmol/L.