[发明专利]用于生产偶姻的方法,其适用的丙酮酸脱羧酶,以及两者的制备,和编码PDC基因的DNA序列

权利要求书

1.一种用于获得一种用于以＞95％对映异构体单位产生(R)-(-)苯基乙酰基甲醇(I)，且(I)/2-羟基乙基苯基甲醇的产物比率＞95％的丙酮酸脱羧酶(PDC)的方法，这种丙酮酸脱羧酶具有关于苯基乙酰基甲醇生成的比活＞1U/mg，通过从生产生物体中分离而获得，其特征在于：应用了一种具有来自运动发酵单胞菌的编码丙酮酸脱羧酶的基因的生产生物体，在其DNA序列的1174-1176位编码色氨酸残基的密码子TGG被编码具有减小的体积(Raumerfullung)的氨基酸残基的密码子替代。

2.权利要求1的方法，其特征在于，密码子TGG被编码一个简单氨基酸残基的密码子替代。

3.权利要求2的方法，其特征在于，密码子TGG被编码一个脂族氨基酸残基的密码子替代。

4.权利要求3的方法，其特征在于，密码子TGG被编码丙氨酸残基的密码子替代。

5.一种丙酮酸脱羧酶，能够在苯甲醛存在时将丙酮酸转化成具有＞95％对映异构体单位的(R)-(-)苯基乙酰基甲醇，且(I)/2-羟基乙基苯基甲酮的产物比率＞95％，该酶关于产物形成的比活＞1U/mg，可以按照权利要求1至3获得，在其392位的色氨酸残基被尺寸较小的氨基酸残基替代。

6.权利要求5的丙酮酸脱羧酶，其特征在于：在392位的色氨酸残基被丙氨酸残基替代。

7.用于在PDC存在时通过酶促偶姻缩合α-酮羧酸和/或乙醛而酶促生成偶姻的方法，其特征在于，作为PDC应用权利要求5或6的酶。

8.权利要求7的方法，其特征在于：出自α-酮羧酸的偶姻缩合，在同时借助于乙醇脱氢酶和NADH而还原过量的、由脱羧基而形成的乙醛的情况下进行。

9.权利要求8的方法，其特征在于：当转化时形成的NAD，在原位通过甲酸盐脱氢酶再生成NADH。

10.在通往活性中心的引导底物通路上具有进入限制的硫胺素焦磷酸盐依赖性酶的基因的DNA序列，其特征在于：在编码进入限制的密码子的位置上引入了一个编码清除了进入限制的氨基酸残基的密码子。

11.权利要求10的DNA序列，其特征在于，来自于运动发酵单胞菌的PDC基因的DNA序列在其1174-1176位上具有编码较小尺寸的氨基酸残基的密码子。

12.权利要求11的DNA序列，其特征在于，在其1174-1176位具有编码脂族氨基酸残基的密码子。

13.权利要求12的DNA序列，其特征在于：在其1174-1176位具有编码丙氨酸残基的密码子。