[发明专利]制备β－内酰胺类抗菌素的方法

说明书

本发明涉及利用以酰化试剂对β-内酰胺环实施酶催化酰化制备β-内酰胺类抗菌素的方法。

这样一种方法例如公开在WO-A-9201061中。在该公开所描述的方法中，使用了大大超过β-内酰胺环数量的酰化试剂。其pH值被调整到某一较低的水平并保持恒定。如果在该方法中酶要重复多次使用，则酶的活性表现出明显下降。

然而在实践中，要获得一种商业上具有吸引力的方法，加入的酶就应当适合重复使用许多次(例如50次以上，尤其是100次以上)而不会显著丧失活性。

本发明的目的就是要获得一种消除了所述缺点的β-内酰胺环的酶催化酰化方法。

按照本发明，该目的是在一种通过以酰化试剂对β-内酰胺环进行酶催化化酰化来制备β-内酰胺类抗菌素的方法实现的，其中β-内酰胺环与酰化试剂之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1，反应混合物中无机盐的浓度低于1000∶n mM，n代表阴离子的化合价，且β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环浓度之和为200～800mM。

事实是本申请人已发现，在连续使用的多个周期中，酶的活性对酶催化  酰化反应期间反应混合物中无机盐的浓度，以及对β-内酰胺类抗菌素与β-内酰胺环的浓度之和存在依赖关系。

可用于本发明方法中的β-内酰胺环的合适例子是青霉烷酸衍生物，例如6-氨基青霉烷酸(6-APA)，以及头孢烷酸衍生物，例如7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、7-氨基去乙酰氧基-头孢烷酸(7-ADCA)及7-氨基-3-氯代头孢烷酸(7-ACCA)。

可用于本发明方法中的合适酰化试剂例如是α-氨基酸衍生物，特别是苯基甘氨酸、对羟苯基甘氨酸以及二氢苯基甘氨酸的酰胺及酯。

原则上，任何适合作为偶合反应催化剂的酶皆可使用。例如，这些酶是一般统称为“青霉素酰胺酶”及“青霉素酰基转移酶”的酶。合适的酶的例子是那些由下列物质衍生的酶：醋酸杆菌、气单孢菌、产碱菌、Aphanocladium、芽孢杆菌sp.、假头状孢子头(Cephalosporium)、埃希氏菌、黄色杆菌、克氏梭菌(Kluyvera)、枝动杆菌、精朊杆菌、假单孢菌及黄单孢菌，特别是巴氏醋杆菌、粪产碱菌、巨大芽孢杆菌、大肠埃希氏菌及柑橘黄单胞菌。

优选的是使用固相酶，因为这种酶易于重复使用。固相酶本身是已知的且有商品供应。特别合适的酶是Boehringer Mannheim公司生产的商品名为Enzygel^的大肠埃希氏菌酶、Recordati公司生产的固相青霉素G酰基转移酶、Hannover药物生物技术公司生产的固相青霉素G酰基转移酶以及按WO-A-92/12782所述提取并按EP-A-222462予以固定的大肠埃希氏菌青霉素酰基转移酶。

该酶催化酰化反应大多在-5～35℃之间进行，特别是在5～35℃之间，优选地在0～28℃之间，最优选在15～28℃之间进行。

实施酰化反应的pH值大多在6～8.5之间。在决定最佳pH值的诸多因素当中特别要注意的是抗菌素，因为β-内酰胺类抗菌素及β-内酰胺环的稳定性及溶解度均与pH值有关。如果使用苯基甘氨酸衍生物作为酰化试剂，pH值优选地为6.2～8.5，最优选为7～8；如果使用对羟苯基甘氨酸衍生物作为酰化试剂，pH值优选地为6～7.5，最优选为6～7。此外，酶的活性也与pH值有关。

在实施过程中，酰化反应大多在水中进行。任选地，反应混合物也可含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选地其含量少于30％(体积)。可使用的有机溶剂的例子是含有1～7个碳原子的醇，例如一元醇，特别是甲醇或乙醇；二元醇，特别是乙二醇或三元醇，特别是甘油。

应选择β-内酰胺类抗菌素的浓度及β-内酰胺环的浓度，使得两种浓度之和为200～800mM。优选的是，选择该浓度，使得两种浓度之和为300～700mM，最优选300～600mM。

酰化试剂与β-内酰胺环之间的摩尔比为0.5∶1～2∶1。优选地为0.7∶1～1.3∶1，最优选0.8∶1～1.2∶1。优选的是，选择酰化试剂与β-内酰胺环之间的摩尔比，使得整个酰化反应期间反应混合物的pH值在不滴加酸的情况下不超过上述极限。

事实是本申请人已发现，如果在上述过程中用滴加强酸来维持pH值恒定，酶的稳定性受到的损害会因向反应混合物中直接加入酸，从而出现所谓的“热点”(低pH点)而加剧。另外，这种现象的出现还因滴加酸而造成盐浓度增加所产生的效应所致。而且发现，这两种影响互为加强。