[发明专利]链激酶基因及其分离与表达

说明书

本发明涉及一种生物工程药物，特别是链激酶的基因及其分离与表达。

链激酶(Streptokinase，简称SK)是由β-溶血性链球菌产生的一种分泌性蛋白，是体内血纤维蛋白溶酶原最有效的活化剂之一。1992年古巴有人在大肠杆菌中表达了链激酶基因(M.P.Estracla et al.High level expression of streptokinase in Escherichia coli.Bio/Technology vol.10，1992；1138-1142)。其方法是：从似马链球菌染色体DNA中钓取分离到SK基因，并将其克隆至分泌性表达载体pEG-3中，诱导培养后，SK以分泌形式表达，重组蛋白约占菌体总蛋白的25％。菌体破碎后重组蛋白先后用亲和层析和阴离子交换层析方法得到SK纯品。此种方法的不足之处主要是表达水平低，给下游的纯化带来不少困难。

1993年国内也有人在大肠杆菌中表达了SK基因，但所用的基因是从国外引进的(丁皓 朱运松等，基因工程链激酶(r-SK)纯化及其单克隆抗体制备和鉴定，生物工程学报10(1)：56-60，1994)。

本发明的目的是从中国人群分离的链球菌中钓取SK基因，提高其在大肠杆菌中的表达水平。

本发明的主要内容是：1、SK基因的分离

从中国人群中分离得到化脓性链球菌，用乙醇沉淀法大量提取其染色体DNA，以所提取的染色体DNA为模板，通过PCR方法(POLYMERASECHAIN REACTION聚合酶链式反应)大量扩增得到目的SK基因。2、SK基因的序列分析

把分离到的SK基因插入M13mp19(单链噬菌体)中，根据相应的酶切位点做四个测序亚克隆，然后对全长SK基因序列进行序列分析。3、高效表达载体的构建

把获得的SK基因和表达载体pBV220分别用EcoR I和BamH I双酶切消化，再用T4DNA连接酶把酶切回收后的pBV220和SK基因定向连接起来，获得有SK基因定向插入的重组表达载体，并命名为pBV-SK。4、SK基因的表达

用热诱导方法诱导SK基因在大肠杆菌中表达。采用SDS-PAGE蛋白电泳法及薄层扫描法测定其表达水平。

本发明从中国人群中分离到的化脓性链球菌中钓取SK基因，SK基因在大肠杆菌中的表达水平占菌体总蛋白的60％以上。序列同源性比较表明其活性部位十分保守，但在非活性部位V1区(第522-732碱基)和V2区(第810-870碱基)有较大变异。重组蛋白的纯化产物具有溶解血块的生物学活性。

实施例1、SK基因的分离

用乙醇沉淀法从中国人群中分离的化脓性链菌中大量提取染色体DNA，设计并合成一对特异性引物，引物序列如下：

上游引物：5’-GGAATTCAATGCAAGCTATTGCCGGGACTG-3’

下游引物：5’-CGGGATCCAGAAGATCGTGGCTATTCATC-3’

以所提取的染色体为模板，通过PCR方法大量扩增得到目的SK基因，PCR反应条件如下：

模板DNA     10μl

上游引物    1μl

下游引物    1μl

dNTP        2μl

10×Buffer  10μl

灭菌水      75.5μl

95℃，10分钟后加入0.5μlTag DNA聚合酶，然后循环30次，每个循环包括94℃ 1’→50℃ 30”→72℃ 70”。2、SK全长序列分析

把得到的SK基因定向插入M13mp19(单链噬菌体)方法如下：

双酶消化：

              SK基因        M13mp19

Ecok1          1μl           1μl

BamH1          1μl           1μl

10×Buffer     2μl           2μl

SK的PCR产物    16μl  M13mp19 2μl

                        灭菌水14μl

               20μl          20μl37℃反应2小时，然后用低熔点琼脂糖的方法分别回收酶切片断。再用T4DNA连接酶把回收后的M13mp19和SK基因连接起来，反应如下：

回收后的SK基因       7μl