[发明专利]金菇多糖锗提取分离与纯化及其对艾滋病病毒逆转录酶的抑制作用

说明书

本发明属生物食用真菌技术领域。

食用菌的药用效果，特别是香菇、金针菇的药用效果已是众所周知的了。据报道。日本已研制成功在培养基中添加二氧化锗，使锗成分被菌丝体同化吸收，这时就可以从菌丝体中提取更有效的药用成份提取液。经过添加二氧化锗的菌丝体提取液，含锗成分为90PPM，并以多糖和锗盐的状态存在，但二氧化锗毒性较大，培养产物分离困难，而不加二氧化锗培养的菌丝体，其提取液含锗成分为1—3PPM。故前者提取液具有更强的降血压，去除胆固醇和抗癌效果。其原因是从外部添加锗在人体中没有活性，如要得到锗的活性物质，就必须制成生物制品，或锗的有机物。

本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种添加有机锗(Ge—132)经培养将有机锗的锗元素与金菇菌代谢产物结合转化为多糖锗，提高锗的生物活性，并将金菇多糖锗提取分离与纯化。

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

一种金菇多糖锗提取分离与纯化法，其特征是取定量金菇锗营养液加水，提取，薄膜浓缩，加入乙醇，离心得深褐色粗多糖制品；将粗多糖制品经H₂O₂处理后，再加入乙醇，离心得淡黄色金菇多糖锗；在多糖水溶液中加入5∶1的氯仿，正丁醇混合剂，离心去除杂蛋白层，糖溶液经水透析，减压浓缩，加入乙醇，得到金菇多糖锗半精品；半精品加入DEAE—sephadexA—25的2.5×3.5cm柱，依次用H₂O，0.15NNaCl，0.25NNaCl进行阶段洗脱，分部收集，经透析，浓缩后加入乙醇，得乳白色金菇多糖锗纯品。

图1是本发明SephadexG—200层析图

图2是本发明金菇多糖锗红外光谱图

图3是本发明金菇多糖锗核磁共振(H—NMR)图谱

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

1.金菇多糖锗的提取分离与纯化

取100ml金菇锗营养液加水，于90℃水浴中搅拌提取二次，每次2小时，合并抽提液，薄膜浓缩到粘稠状，离心去除不溶物，加入6倍量95％乙醇，离心得到深褐色粗多糖制品。

为脱去粗金菇多糖锗中含有的色素，将10％粗多糖溶液在50℃水浴保温，调PH至8.5，经H₂O₂处理后，再加入5倍量95％乙醇，于冰箱放置过夜，次日离心得到淡黄色的金菇多糖锗。

采用Sevag法将脱色的金菇多糖锗进行去杂蛋白处理。在多糖水溶液中加入氯仿，正丁醇(5∶1)之混合剂，振荡30分钟后，离心去除杂蛋白层，按上法，重复数次，去尽杂蛋白。糖溶液经水透析72小时，减压浓缩至粘稠状，加入5倍量95％乙醇，离心，沉淀，依次用乙醇，丙酮洗涤后，P₂O₂真空干燥得到金菇多糖锗半精品。

取金菇多糖锗半精品，溶于少量水中，去杂后，加入DEAE—sepadexA—25柱(2.5×3.5cm)，依次用H₂O，0.15NNaCl，0.25NNaCl进行阶段洗脱，分部收集，用蒽酮比色法测定各管糖含量，以鉴定多糖部位，合并多糖部位试管溶液，经透析，浓缩后加入5倍量95％乙醇，得到乳白色金菇多糖锗纯品。

该纯品安全、无毒、符合食品的基本要求。

2.金菇多糖锗的分析鉴定

(1)多糖的一般性质

多糖水溶液，经紫外线扫描，在紫外区域无特征吸收，不含有蛋白质和核酸。多糖在水解前对Fehling试剂呈阴性反应，当用盐酸水解后，与Fehling试剂发生反应，产生棕红色沉淀。多糖与α—奈酚硫酸试剂反应产生紫红色环，与硫酸—苯酚试剂反应产生桔黄色，将多糖的水溶液点在滤纸上用schiff试剂染色呈红色，用甲苯胺蓝染色呈蓝色，具有一般多糖的性质。

(2)多糖的纯度鉴定

凝胶柱层析：取样品15mg，上sephadex G—200柱(2.5×30cm)，用0.05NNacl洗脱流速4—5ml/hr，每管收集2ml，蒽酮法测定含糖部位，结果发现为单—峰，其洗脱峰体积分别在50ml，如图1所示。

超速离心：多糖溶解于0.85％NaCl溶液中，在MSE75centriscan型分析超速离心机上分离，转速50000r、p、m、结果显示为单一区带，使用schliercn光学系统进行光电扫描，图谱显示为单峰。

纸层析：多糖水溶液，点样于新华3号滤纸，展开剂为正丙醇∶浓氨水∶水＝40∶50∶5室温上行展开13cm，吹干后以0.5％甲苯胺蓝乙醇溶液染色，95％乙醇漂洗背景，结果为单一斑点。

(3)多糖的理化分析