[发明专利]重组类似胰蛋白酶的蛋白酶

说明书

本发明涉及一种具活性的重组类似胰蛋白酶的蛋白酶，一种包含该类似胰蛋白酶的蛋白酶的蛋白水解组合物，一种包含编码所说类似胰蛋白酶的蛋白酶DNA序列的DNA构建物，以及包含该DNA构建物的载体和细胞。并且本发明还涉及一种通过使用重组DNA技术制备该类似胰蛋白酶的蛋白酶的方法。

蛋白酶被广泛地用作商业洗涤剂的成份，以提高对蛋白质组成的污垢的去污力。多年来，具有广范围专一性的蛋白酶，如枯草杆菌蛋白酶(芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶)是使用最广泛的洗涤剂蛋白酶。然而，近年来具有较窄范围专一性的蛋白酶在洗涤剂中的应用已引起日益增多的关注。

WO89/06270公开了一种洗涤剂组合物，其含有窄范围底物专一性的蛋白酶，即类似胰蛋白酶的蛋白酶，其能够断裂赖氨酸或精氨酸C末端的钛键。公开于所述参考文献中的类似胰蛋白酶的蛋白酶通过常规的镰孢霉属(Fusarium sp.)菌株尖孢镰孢(F.oxysporum)DSM2672的发酵来生产，并且不可避免地与另一种蛋白酶(蛋白酶1)一同产生，而在洗涤剂组合物中不需要蛋白酶1的存在。因此，来自尖孢镰孢菌株的类似胰蛋白酶的蛋白酶的生产包含从类似胰蛋白酶的蛋白酶中分离出不需要的蛋白酶这一步骤，这样就使得类似胰蛋白酶的蛋白酶的大规模生产成本比所希望的要高。所以需要使所述镰孢霉属的类似胰蛋白酶的蛋白酶的生产变得容易方便，尤其是避免上述不需要的蛋白酶1的同时产生，以能够生产出更多产量的酶及能以比现有技术更为经济的方式进行生产。

本发明人现已成功地实现了编码镰孢霉属类似胰蛋白酶的蛋白酶的DNA序列的克隆，并从所述DNA序列中得到了具活性的类似胰蛋白酶的蛋白酶的表达。

因此，本发明的一方面涉及一种具有活性的重组类似胰蛋白酶的蛋白酶，其包含有氨基酸序列的1—224氨基酸残基，氨基酸序列示于所附SEQ ID No.2。

本发明中的术语“类似胰蛋白酶的蛋白酶”是指一种具有类似胰蛋白酶活性的酶，即能够切断赖氨酸或精氨酸C末端的肽键。该类似胰蛋白酶的蛋白酶活性的测定可通过基于胰蛋白酶底物如N—苯甲酰基—L—精氨酸—对—硝基苯胺盐酸化物(L—BAPA或L—BApNA)的测定来进行，例如描述于下面的“材料和方法”部分中。

有关本发明的类似胰蛋白酶的蛋白酶中所用的术语“重组”是指通过以编码蛋白酶的DNA序列转化的细胞来生产蛋白酶。因此，重组类似胰蛋白酶的蛋白酶是通过另一种微生物而非其亲本微生物来生产的，所以该蛋白酶基本上不含所述亲本微生物产生的组分，即由尖孢镰孢株DSM 2672生产的组分。这些组分可使蛋白酶具有不需要的性质。如产生不需要的酶活力。在这一方面，可以容易地生产本发明的重组类似胰蛋白酶的蛋白酶而不含有蛋白酶1，并且也不需要类似于WO 89/06270中所进行的昂贵的分离步骤。

在导致本发明的研究过程中，即下述实施例所详细描述的本发明，非常意外地发现，通过对SEQ ID No.1所示的DNA序列转化的微生物(米曲霉Aspergillus oryzae)这一常规使用的生产菌株进行培养，很难得到活性类似胰蛋白酶的蛋白酶的任一基本产品。在对该DNA序列和表达产品进行分析的基础上发现，以该DNA序列编码的酶被表达为非活性的酶原，并且有大量的这种酶原被表达。因此，即使可获得大量的活性酶的前体形式，也得不到一点具有活性的成熟酶，而且已得出结论，酶原在米曲霉发酵液中不稳定。

令人惊奇地发现，如果对包含编码酶的酶原形式的DNA序列的宿主细胞在培养基中进行培养，同时培养基中也含能将该酶原原位转化为活性酶的蛋白水解酶，则活性重组类似胰蛋白酶的蛋白酶的产量能大大提高。我们认为，当其它蛋白水解酶不存在时表达的低酶活力可归因于非活性的类似胰蛋白酶的夤白酶的酶原形式很不稳定，并很快地由宿主微生物表达的蛋白水解酶降解，并且当加入一种蛋白水解酶，其比降解酶原的蛋白水解酶反应要快，则其与酶原反应导致成熟的活性类似胰蛋白酶的蛋白酶的产生。本发明的另一方面涉及含有编码上述本发明活性重组类似胰蛋白酶的蛋白酶DNA序列的DNA构建物。

本发明的另一方面涉及含有本发明DNA构建物的重组表达载体，涉及含有本发明DNA构建物或表达载体的细胞，并涉及本发明类似胰蛋白酶的蛋白酶的生产工艺，其中对如上所述的本发明细胞在有助于蛋白酶生产的培养条件下培养，并随后从培养物中回收该蛋白酶。

最后，本发明涉及含有本发明活性类似胰蛋白酶的蛋白酶的洗涤剂添加剂及洗涤剂组合物。