[发明专利]反式－4－羟基－L－脯氨酸的制造方法

说明书

本发明涉及工业上制造作为药品合成原料或食品添加剂的有用的反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法的有用的新的L-脯氨酸4位羟基化酶。

使用微生物制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法已经公知的有：

1)使用属于大肠杆菌属(Escherichia)的微生物，从4-羟基-2-酮戊二酸制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法(特开平3-266995)，

2)使用霉菌类直接发酵生产的方法(欧洲专利申请EP0547898A2)

3)使用属于链霉菌属的微生物，从L-脯氨酸制造的方法〔Journal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem)，254卷，6684-6690页(1979年)、Biochemical and Biophysical ResearchCommunication(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，120卷，45-51页(1984年)〕。

上述(1)的方法中，4-羟基-2-酮戊二酸昂贵而且难以得到，生产率低，(2)的方法生产率也低，而(3)的方法中，涉及制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的酶的活性极其微弱，反应生成物是微量的，必须用放射性化合物才能检测出来，所以上述任何一种方法用在工业生产上都是困难的。

对于催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶，在不离析出的状态下，使用来自属于指孢囊菌属或者Amgcolatopsis属的微生物作为催化从L-脯氨酸向反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶源，制备反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，目前尚未为人知。另外，曾有报导过从上述的链霉菌属的微生物精制L-脯氨酸4位羟基化酶〔(TetrahedronLetters)，34卷，7489-7492页(1993年)〕，但对于精制酶的方法，被精制酶的纯度以及酶的理化性质等均没有记载。总之，将游离的L-脯氨酸羟基化，催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应的L-脯氨酸4位羟基化酶，在此之前没有分离出，并且是理化性质不明确的酶。

以往的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法有(1)原料昂贵，(2)反应工序多，(3)分离精制工序复杂，(4)生产率低等缺点，作为工业上的制造方法未必是满意的，所以需要一种在工业生产上有利的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法。

本发明的目的在于提供一种利用发酵法将由糖源工业规模地生产出的L-脯氨酸作为原料，通过直接用微生物或酶进行羟基化处理后，工业规模地且方便地制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法及用于该方法的L-脯氨酸4位羟基化酶。

按照本发明，可以提供反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法及L-脯氨酸4位羟基化酶，其特征是将来自指孢囊菌属或Amycolatopsis属的微生物且能在L-脯氨酸的4位上催化羟基化反应的酶源、二价铁离子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介质中，使得L-脯氨酸转化成反式-4-羟基-L-脯氨酸，而后从该水溶性介质中提取反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法以及L-脯氨酸4位羟基化酶。

本发明中所使用的酶源，只要是来自属于指孢囊菌(Dactylosporangium)属或Amycolatopsis属的微生物，且具有能羟基化L-脯氨酸，生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性，任何的微生物培养物、菌体、菌体处理物、精制酶或粗酶都可以。作为微生物的合适例子可举出指孢囊菌、(Dactylopsorangium sp.)RH1、Amycolattopsis菌(Amycolatopsis sp.)RH2或这些菌株的继代培养物、突变体或诱变体等。

RH1将是从东京都的树木、RH2株从埼玉县的土壤中由本发明者所分离出的微生物。以下说明RH1及RH2的菌学性质。

1.形态的性质

RH1及RH2在各种培养基上，在28℃下培养14天时的形态性质，表示在表1中

                    表1