[发明专利]含脂细菌荚膜多糖转化为无脂多糖的方法

说明书

本发明由包括来自革兰氏阴性细菌的特定型荚膜多糖的细菌培养基中制备无脂的荚膜多糖，没有内毒素，不会遭到荚膜多糖的基本损失。该方法将具有共价结合的甘油二酯部分的荚膜多糖转化为无脂多糖。在本发明的优选方案中，脂多糖、LPS或内毒素也由荚膜多糖中除去，而共价脂已由荚膜多糖解离。

本发明的方案中，方法用于制备无脂多核糖基核糖醇磷酸酯，这里称为PRP，它是由致病的细菌流感嗜血杆菌（Haemophilus    influenzae）b型，也称为Hib，的培养基中产生的荚膜多糖。所产生的PRP是适于作为制备疫苗的组成，该疫苗用于诱导防止因Hib引起的疾病发展的免疫应答。由本发明，可以预见到，其它的具有类似共价脂的致病细菌，如大肠杆菌（E.coli）或脑膜炎双球菌（Neis-seria    meningitidis）中的荚膜多糖，使用本文公开的报导，也可以按同样高产率进行生产。

致病性细菌，Hib，对许多疾病可应答，其中最重要的是细菌性脑膜炎和全身细菌性疾病，它主要发生在5岁以下的儿童中。目前，针对Hib的疫苗已由FDA许可使用于人类，参阅1991 physicians Desk Reference，pp 1476-1478（Merck & Co.Inc′s PedvaxHIB）pp1174-1176（lederle′s Hib TITER）。

描述于美国专利US4695624和US4882317的方法提供了一种生产抗Hib的疫苗。在该方法中所用的PRP是由培养的流感嗜血杆菌b型中得来的，并由培养基分离部分多糖。然后将分离的PRP与由脑膜炎双球菌b的外膜蛋白络合物相结合，它作为PRP的免疫加强载体，而本身对幼儿是缺乏产生免疫性的。

现在涉及美国专利US4695624，将800升    b型流感嗜血杆菌发酵物浓缩（16栏24行）到377克湿膏体物。通过在有氧化钙的不同浓度的乙醇中的选择沉淀回收PRP。得到68克干产品（17栏第1行），下文称为苯酚前粉末。进一步的工作包括苯酚提取和乙醇沉淀，产生39克干产品（17栏，49行）然后最终以34.7克干产品结束（18栏14行）。这种材料下文称为苯酚后粉末。该苯酚后粉末可以结合或进行再纯化以除去内毒素。

内毒素是在以细菌衍生的免疫原接种时，哺乳动物内温度提高的主要原因。通过除去脂A的脂多糖，可以消除这种所谓的致热应答。下文认为与免疫原的内毒素、热原或LPS是同义的。为了达到这目的，上面所得苯酚后PRP产品可以进一步纯化，以致进行调节对热原的标准。在本发明研制以前，通过选择性乙醇分馏在苯酚后粉末中损失所存在的PRP约70%而达到目的。这包括通过加入足够浓度的乙醇以刚好开始沉淀，即在美国专利US5039610和U.S.S.N.595722中略述的所谓浊点而由苯酚后PRP中沉淀LPS。将乙醇加到浊点，这时在浊度方面达到约二倍的增加。再加入0.5～2%乙醇，至此得到一种废产品的沉淀，下文称为低切（low-cut），而无脂PRP留在溶液中。低切含有约70%PRP和基本全部LPS。

企图克服因除去内毒素的选择乙醇分馏所导致的PRP损失，美国专利US5019502方法的发明者研制了一种方法以除去LPS而基本不损失PRP。该方法包括将溶解的苯酚后粉末通过一增水性吸附步骤，或者按批量模式或按柱色层模式，而且最好使用一种结合内毒素而不结合多糖的非离子型树脂。

使用一种高度多孔的苯乙烯和二乙烯苯共聚体的树脂，例如HP20，果真可以基本上定量地除去全部内毒素而提供几乎定量产额的PRP。这种材料在下文称为HP20-后PRP。但是，由Hib产生的PRP的主要部分是呈共价脂肪-PRP。

由流感嗜血杆菌b型产生的PRP可能是脂肪-PRP，首先由Kuo等人[J.Bacteriol，163，769-773（1985）]所认识，其中流感嗜血杆菌b型是在加有放射性棕榈酸和/或放射性核糖的液体培养基中生长的。由培养基上清液纯化的多核糖基核糖醇磷酸脂含有放射性核糖和棕榈酸两种，它们在生物合成期间掺入PRP。表明磷脂酶A₂（PLA₂）处理可由PRP除去某些放射性棕榈酯，因而，破坏非共价结合的方法是不成功的。没有给出脂肪-PRP的结构，但是所列数据与早期文献中所报导的数据相一致，该文献提出了脑膜炎球菌A、B、C和大肠杆菌K92多糖的结构[Gotschlich等人，J.Biol.chem.256.8915-8921（1981）]。在本发明中，以特定的磷脂酶研究，揭示了脂肪-PRP的结构，它与下面详述所列出的一致。