[发明专利]含脂细菌荚膜多糖转化为无脂多糖的方法

权利要求书

1、一种由粗制或纯化的包括由细菌衍生的无脂或有脂两者的荚膜多糖的制剂中制备无脂和无内毒素的荚膜多糖而基本上不损失荚膜多糖的方法，该方法包括由脂荚膜多糖分裂脂，除去无脂和内毒素的污染并回收无脂荚膜多糖，而基本上将全部脂荚膜多糖转化成多脂荚膜多糖。

2、权利要求1的方法，其中脂是通过磷脂酶而从脂荚膜多糖中离解。

3、权利要求2的方法，其中荚膜多糖是由流感嗜血杆菌b型，脑膜炎双球菌（脑膜炎球菌）群A、B、C、X、Y、W135或29E或大肠杆菌K1、K12、K13、K89、K92或K100的培养物中衍生的。

4、权利要求3的方法，其中荚膜多糖是包括由流感嗜血杆菌b型培养物衍生的PRP和脂-PRP。

5、权利要求4的方法，包括在有作为酶活化剂的含醚有机相存在下，用单独的磷脂酶D或磷脂酶D与磷酯酶A₂或磷酯酶B组合物处理包括PRP和脂肪-PRP的混合物。

6、权利要求5的方法，其中有机相包括选自乙醚，丁醚、甲基叔丁醚的第一组成醚，和选自甲醇、乙醇或己烷的第二组成的混合物，其中所述第一组成和所述第二组成存在的比例为约20∶1和5∶1之间。

7、权利要求6的方法，其中磷脂酶是由非哺乳动物有机体中衍生的。

8、权利要求7的方法，其中包括用单独磷脂酶D处理含有PRP和脂肪-PRP的混合物。

9、权利要求8的方法，它包括将含有PRP和脂肪-PRP的混合物与按重量计约0.01和10%之间的磷脂酶D进行反应。

10、一种制备无脂和无内毒素的多核糖基核糖醇磷酸盐（PRP）而基本不损失PRP的方法，它包括将以由流感嗜血杆菌b型培养物得到的粗制或纯化的多糖制剂存在的脂肪-PRP按0.3%（重量）磷脂酶D对PRP的比例与磷脂酶D反应，在反应混合物中含有浓度为反应体积的30%-60%之间的醚：有机溶剂混合物，其中有机物是一种选自二乙醚、丁醚或甲基叔丁基醚的醚与一种选自己烷、乙醇或甲醇的第二有机物相混，反应是在有选自脱氧胆酸盐或Triton X-100的去污剂存在下，其浓度为约0.1%～0.4%之间，并加入约0.1～10mMCaCl₂，在适宜上述试剂的缓冲溶液中，PH值在约7.0～8.0之间温度在约20℃～45℃之间，进行约30分钟～约4小时之间。

11、权利要求10的方法，其中的醚∶有机溶剂混合物是甲基叔丁基醚∶乙醇的混合物，其比例为约9∶1，混合物的浓度是反应体积的约50%。

12、权利要求11的方法，它还包括PRP的苯酚提取以除去包括所加入的磷脂酶D的蛋白的污染，并在磷脂酶D处理前或处理后，将PRP通过一不吸附PRP或脂肪-PRP的憎水吸附步骤以除去脂和内毒素。

13、一种制备无脂PRP而基本上不损失PRP的方法，它包括的步骤有：

a）在合适的培养基中培养流感嗜血杆菌b型;

b）用乙基汞硫代水杨酸钠或苯酚杀死流感嗜血杆菌b型;

c）澄清杀死流感嗜血杆菌b型的培养基;

d）浓缩澄清的培养基到得到可加工的体积;

e）通过加入乙醇使最终浓度为约48%乙醇而沉淀在培养基中的污染物以得到含PRP的上清液和要弃去的污染物沉淀;

f）通过加入乙醇使最终浓度为约61%而沉淀PRP以得到粗制PRP沉淀;

g）在PRP沉淀中加入水以溶解，接着加入氯化钙使最终浓度为1.0M;

h）加入乙醇使最终浓度为23%，以得到污染物的不溶沉淀和含PRP的上清液;

i）加入乙醇使最终浓度为37%以沉淀PRP;

j）用无水乙醇研制PRP沉淀并干燥而得到一种PRP苯酚前粉末;

k）苯酚提取一种PRP粉末的溶解制剂;

l）通过加入CaCl₂至0.05M和乙醇至约67%而沉淀PRP，在无水乙醇中研制以得到苯酚后粉末。

m）通过增水吸附，由苯酚后粉末的溶解制剂中除去内毒素;

n）将在粗制PRP、苯酚前粉末或苯酚后粉末中的PRP，在进行以后步骤之前与磷脂酶反应。

14、权利要求13的方法，其中磷脂酶是磷脂酶D，它的加入量为PRP的约0.3%（重量），而粗制PRP，苯酚前粉末或苯酚后粉末是溶于10mM Tris、5mM CaCl₂、45%甲基叔丁醚、5%乙醇、0.3% Triton X-100，并在约35℃反应30分钟到约4小时。