[发明专利]一种新的(ZSP)大豆原生质体培养基

说明书

该发明属于生物技术领域。具体的讲，发明属植物生物技术的大豆生物技术研究领域。

无论在大豆细胞工程还是在基因操作研究中，建立原生质体培养系一直为国内外学者所关注。栽培大豆（Glycine  max  L.）原生质体研究方面，虽然由悬浮细胞、未成熟的荚果组织、幼苗根、叶肉组织、未成熟或成熟子叶和下胚轴及下胚轴发生的悬浮培养细胞游离的原生质体可持续分裂获得愈伤组织、甚至由愈伤分化只形成了根，直至1988年以后卫志明、罗希明等人才从未成熟子叶游离原生质体再生成植株。大豆野生种G.canescens、G.clandestina、G.argyrea和G.soia的原生质体培养也已有再生植株或形成芽的报导。不过，他们均采用了非胚性愈伤组织，通过器官发生途径诱导植株再生。这种途径重复性很差，不便于进行细胞工程和基因操作。大量试验表明，若不建立胚性愈伤组织或胚性细胞系，很难使原生质体形成再生植株。在诱发或保持胚性状态中，选择适宜的培养基是十分必要的。

在大豆原生质体培养中，国内外多采用K₈P培养基和MS培养基为基本培养基，还有Gamborg等人设计的B₅培养基，以及用MS培养基无机成分加B₅培养基有机成分为基本培养基的MSB培养基等。这些培养基只能使大豆原生质体培养成非胚性愈伤组织，不能形成胚性愈伤组织或胚性细胞系。所以直至1990年，未见大豆原生质体培养成胚性愈伤组织，通过胚胎发生途径诱导植株再生的报导。1990年我们根据大豆氮代谢的特点，以及大豆未成熟子叶的细胞分裂与生长期代谢机理，研制了一种新的（ZSP）大豆原生质体培养基，使栽培大豆（Glycine max L.）的未成熟子叶游离的原生质体，形成了胚性愈伤组织。该愈伤组织在体细胞胚分化培养基上，直接分化出体细胞胚，并进一步诱导出再生植株，进入正常发育而开花。

以大豆根瘤形成的酰尿等特异有机态氮化合为主要氮源，并使大豆原生质体形成胚性愈伤组织的培养基迄今尚未见报导，确属一种新的大原生质体培养基。

建立胚性愈伤组织或胚性细胞系，可通过胚胎发生途径，诱发再生植株，以建立有效而可靠的大豆原生质体培养系，可进行细胞杂交和基因工程，扩大大豆变异幅度，拓宽遗传资源，改革大豆常规育种程序，快速选育高产、优质、高抗大豆品种。

在建立上述原生质体培养系中，首先要建立胚性愈伤组织或胚性细胞系。在诱发或保持胚性状态中，创造适宜的培养基是十分必要。所以能使大豆原生质体形成胚性愈伤组织的新的（ZSP）大豆原生质体培养基的发明，不仅为建立有效而可靠的大豆原生质体培养系起重要作用，而且为大豆细胞工程和基因操作奠定重要基础。它为开发与应用大豆生物技术将起积极作用。

培养基成分应根据培养物的植物种、组织、器官和培养目的而决定。大豆的氮素营养主要是由根瘤固氮形成的酰尿和土壤中吸收的硝酸态氮、天冬酰胺分配到地上部而被利用。大豆根瘤固定的氮素先形成天冬酰胺和谷氨酰胺，进而形成尿囊素和尿囊酸（主要是后者）运输到豆荚和生长中的籽粒细胞，大部分由氨基酸代谢形成蛋白质，所以大豆也称为酰尿植物。酰尿的C/N比低，可高效率地使碳水化合物释放出大量的还原态氮。

故一种新的（ZSP）大豆原生质体培养基，大量元素为1/2MS（但硝酸铵为1/40），以天冬酰胺、谷氨酰胺、尿囊素和尿囊酸等大豆根瘤形成的酰尿特异有机态化合物为主要氮源，调节NH⁺₄.NO^-₃和PH，微量元素同MS，有机成分是在MS基础上增加维生素B₁和Casamino acid，附加2.4-D、BA等激素。适量的蔗糖为碳源并用甘露醇调节渗透压。培养基成分组成及其配方如下：

（A）

 成分                          含量（mg/l)                

NH₄NO₃40

KNO₃950

KH₂PO₄85

H₃BO₃6.2

MnSO₄·4H₂O 22.3

ZnSO₄·7H₂O 8.6

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25