[发明专利]克隆和/或表达的新载体其制备方法及应用

说明书

本发明涉及在革兰氏阴性细菌之广泛宿主中克隆和/或表达的新载体。本发明还涉及这些载体的应用，特别是这些载体在生产重组蛋白质或代谢产物中或生物转化反应中的应用，以及含有这些载体的宿主细胞。

分子生物学的最新进展导致可用于遗传基因方法之具有广泛宿主之新载体的开发。这些载体与那些具有窄范围宿主特异性的载体(如ColE1)截然不同，特征在于这些载体可在分类学上普遍存在的宿主内复制。就可在几乎所有革兰氏阴性细菌内复制的某些质粒来说，这一特性是很明显的。这样的质粒具有特别适用于大肠杆菌等细菌，以进行必要的构建，然后直接引入所选择之革兰氏阴性宿主的特点。这些载体的另一个特点是它们具有由供体细菌向受体细菌接合转移的迁移或被迁移性质。这种转移一般可以很高频率进行(在1-10^-2之间)，此大大高于已知的转化系统。

文献中描述的在革兰氏细菌中有广泛宿主的质粒属于不相容性C、N、P、Q和W组群(incC、incN、incP、incQ和incW)。其中已对不相容性组群P和Q作了充分研究，并已构建了大量的衍生物(Schmidhauser et al.，1988)。这些组群也是几乎无例外地得到了应用。在这方面，还描述过这些质粒在除黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)、Bradyrhizobium japonicum和拟杆菌属(Bacteroides)外之所有革兰氏阴性细菌中的复制情况(Kües and Stahl，1989)。对不相容性W组群质粒的使用并不太重要，这一方面是因为它们的优点比不相容性P和Q组群质粒少，另外是对它们了解尚不多。

不相容性F组群分两个亚群：incPα和incPβ，其中研究最多的是质粒RK2、RP4(事实上它们是同种质粒的两个不同的分离物)和R751。这些质粒具有自动接合特性，即它们都具有接合功能(tra和mob)。此外，它们都是具有低拷贝数(RK2在大肠杆菌内的拷贝数为4-7)的大质粒(RK2有60Kb的尾部)。

Kües和Stahl已详细研究了这些质粒的复制情况。另外，已经知道复制原点oriv由(i)8个17pb的片段、(ii)大肠杆菌之DnaA蛋白质固定位点周围的推断的启动子和推断的大肠杆菌之IHF蛋白质固定位点、(iii)富含AT的9bp序列及相接的DnaA蛋白质固定位点，以及(iv)一个富含GC的区域组成。与trfA基因相关联的复制原点构成与RK2同样普遍存在的复制子，其中所说的trf基因转译成由相同相编码的两种蛋白质A1和A2，且该基因被赋予了不同的密码子。就这些宿主来说，A2，或者A1与A2两者对其复制似乎都是必不可少的(Thomas，1986)。这些质粒的复制受到Kil和Kor基因所介入的复合调节系统的控制。Kor基因(Kil-override)拮抗Kil基因(KilA、KilB、KilC和KilD)的致死性作用，并且对trfA的表达起付调节作用。已鉴定出五个Kor基因(KorA、KorB、KorC、KorE和KorF)。鉴于RK2复制子能适应于用来进行复制的宿主，故证实了存在这些基因及trf基因之调节网(Kües and Stahl，1989)。Schmidhauser和Helinski(1985)也证明当在某些宿主中有较差的分离稳定性时，可造成其中某些基因的缺失。

因此可见，这些基因对于所观察到的RK2或RP4衍生物的好的稳定性是不可缺少的。