[发明专利]乙肝速测试剂药盒及其制备方法

说明书

本发明属于免疫学检验技术领域，主要适用于乙型肝炎五项指标的快速检验、测试。

我国属于肝炎高发区，全国肝炎病人两千七百万之多，每年新发病例九百万之多，乙型肝炎病毒携带者也高达一亿人左右，是危害较大的重要传染病之一。在本发明以前的现有技术中，对乙肝五项指标(HBsAg-表面抗原、抗-HBs-表面抗体、HBeAg-e抗原、HBe-e抗体、抗-HBc核心抗体)的诊断方法及其相应的试剂已有不少，如：对流免疫电泳法(CIEP)、间接血凝抑制法(HAI)、免疫血凝粘附法(IAHA)、反向间接血凝法(RPHA)等，其中近年来被普遍采用的敏感度高、特异性好的试验主要有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELLSA)以及免疫电镜法(IEM)。但是，由于乙肝病毒具有三类抗原及相应的抗体系统，需检测的标准很多，而目前上述多种检测方法，大多不成系列，引起检测上的不便。有的虽然敏感度高、特异性好，但不够简便、快速，或者检验成本太高；有的虽然简便、快速，但敏感度和特异性又欠佳。因此，建立一套敏、准、快、简的系列乙肝检测诊断方法及配套试剂，是免疫、传染病临床检验等医学界竞相研究的课题。

针对上述现有技术状况，本发明的目的之一在于提供一套药盒形式的敏、准、快、简的系列乳凝集乙肝检测试剂；本发明的目的之二在于为上述试剂提供简易可行的工艺制备方法。

现将本发明构思及技术解决方案叙述如下：

本发明从研制新型免疫载体入手，成功地研制出新的乙肝五项指标的系列检测诊断方法及相应试剂。试验方法包括：乳凝集试验、反向乳凝集试验、乳凝集抑制试验，进行上述各乳凝试验，与酶联免疫吸附法进行对比，试验的结果表明，五项指标(即通常所说的两对半)的附合率均在86.3％～96.0％之间，其特异性与敏感性良好。阻断试验表明上述试验确属于特异性反应。乳凝集试验及反向乳凝集试验的反应时间仅需要3分钟，乳凝抑制试验的时间仅需要30分钟，所有试验不需要任何设备，操作简便，反应快速，易于推广。本发明所提供的乳凝集系列检测试剂的试剂药盒形式，包括六个小瓶分装的六种试剂，其中测抗-HBsAg、抗-HBeAg、抗-HBcAg的乳凝抑制试验所用的抑制抗原是直接利用了纯化的HBsAg、HBeAg、HBcAg，分别将其做为(4)、(5)、(6)号试剂，其特征在于；其余三种试剂的组成分别为：

(1)HBsAg反向乳凝试剂组成：聚苯乙烯胶乳上包被有抗-HBs单克隆抗体；

(2)抗-HBc乳凝抑制试剂组成：聚苯乙烯胶乳上包被有抗-HBc单克隆抗体；

(3)HBeAg反向乳凝试剂组成：聚苯乙烯胶乳上包被有抗-HBe单克隆抗体。

聚苯乙烯胶乳的体积百分含量为5％，各抗体与聚苯乙烯胶乳的体积百分比为1∶20。

在上述试验的基础上，本发明为上述试验所用试剂提供了一套简易可行的工艺制备方法，所制备的试剂为(1)HBsAg反向乳凝试剂、(2)抗-HBc乳凝抑制试剂、(3)HBeAg反向乳凝试剂；采用聚苯乙烯作为载体，取抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc单克隆抗体各一份，分别与等容量的体积百分含量为5％的聚苯乙烯胶乳混匀，每组置37℃水浴中30分钟，每10分钟摇一次，以3000转/分转速进行分离，弃去上清液，剩下沉淀用体积百分比为0.4％的牛血清白蛋白生理盐水悬浮至体积百分比为1％乳浓，用各致敏抗体的相应抗原按不同稀释度倍比稀释后测效价。各抗体与聚苯乙烯胶乳的最合适体积比例为1∶20。

六种试剂的实施用法为：

(1)测HBsAg、HBeAg(反向乳凝试验)：取病人血清25微升滴于清洁的乳凝反应圈内；分别加25微升(1)号HBsAg反向乳凝试剂和(3)号HBeAg反向乳凝试剂，用清洁小棒混匀；连续转摇1～3分钟，然后立即记录结果；出现清晰凝集者为阳性，不凝集或可疑凝集者为阴性，如果测效价可将阳性标本用生理盐水作倍比稀释检测，以定效价。

(2)测抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc(乳凝抑制试验)：取病人血清及阴性对照血清各25微升分别滴于清洁的乳凝反应圈内；分别加25微升纯化的(4)、(5)、(6)号试剂HBsAg、HBeAg、HBcAg做为抑制抗原，抑制标本的抗-HBsAg、抗-HBeAg、抗-HBcAg与反向乳凝试剂发生凝集反应，用小棒浊匀，置37℃温箱孵育5分钟，然后各加25微升(1)、(2)、(3)号试剂写上试剂名称，混匀、摇动反应板，5分钟后观察结果，出现清晰凝集者为阴性，不凝集或可疑凝集者为阳性。

凝集反应强度的判断标准为：

“++++”全部呈颗粒状凝集，周围边有凝集圈，液体清亮；