[发明专利]一种Taq DNA聚合酶突变体

说明书

本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；(2)E507Q、R716K；(3)E734N。本发明Taq DNA聚合酶突变体相较于野生型酶在热稳定性、活性或者灵敏度方面得到提高，使扩增效果更加好。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。

背景技术

Taq DNA聚合酶的基因全长为2496bp，编码832aa，分子量大小为94kD，是一种耐热的聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。Taq DNA聚合酶有三个结构域，N端结构域(1～290)具有一个5’→3’核酸外切酶活性，金属离子(Zn²⁺和Mg²⁺)的结合位点也位于该区域。C端(424～832)具有5’→3’聚合酶反应的结构域，该结构域状若人之右手，主要由拇指、手指和手掌三个结构域构成。拇指区域主要作用是结合引物-模板的复合物，手指区域负责与单链DNA模板相互作用及接纳脱氧核糖核苷酸dNTPs，且每接纳一个核苷酸dNTP，手指指尖部分就会向内侧移动而形成闭合结构。手掌区域的功能是催化脱氧核糖核酸核苷酸聚合反应，同时也能起到接纳dNTP的作用。Taq DNA聚合酶的第三个结构域(292～423)与大肠杆菌的DNA聚合酶Pol I具有结构同源性但序列相似度不高，所以TaqDNA聚合酶不具有大肠杆菌DNA聚合酶Pol I的3’→5’核酸外切酶活性，在合成当中对于单核苷酸的错配不具有校正功能，从而不能使产物具有好的保真性。Taq DNA聚合酶最适温度为70～75℃(催化活性最高的温度)，其催化延伸效率可达150bp/s。Taq DNA聚合酶在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃下5-6min可保持约50％的酶活性。研究者将Taq DNA聚合酶应用于PCR技术，使得PCR的过程实现了自动连续循环。

Taq DNA聚合酶广泛用于基因工程技术，包括DNA克隆、基因诱变、DNA标记、测序和其他体外DNA操作。Taq DNA聚合酶在RT-PCR中发挥了至关重要的作用。不仅如此，Taq DNA聚合酶在其他人畜流行疾病的诊断和检测中也有十分广泛的应用，例如非洲猪瘟检测等。尽管如此，TaqDNA聚合酶仍存在一些不足之处，稳定性、检测灵敏性、活性等仍然有待进一步提高。随着PCR和RT-PCR技术的普遍应用，对Taq DNA聚合酶性质的研究日渐重要。

因此，通过蛋白工程的手段增强Taq DNA聚合酶的热稳定性、灵敏度以及PCR活性可以扩展现有应用范围，也可以设计新的应用形式，而且对于提升Taq DNA聚合酶的临床诊断具有重要的意义。

公开号为CN114774384A的发明申请公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其筛选方法，该Taq DNA聚合酶突变体是通过对732位进行饱和突变后筛选获得的，与未经改造的野生型Taq酶相比，特异性和活性均有明显的提高，但热稳定性、活性、灵敏度等方面都还待进一步提高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种Taq DNA聚合酶突变体。

一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：

(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；

(2)E507Q、R716K；

(3)E734N。

本发明又提供了所述Taq DNA聚合酶突变体的编码基因。

本发明又提供了一种包含所述编码基因的重组载体。