[发明专利]一种新金色分枝杆菌重组表达载体及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种新金色分支杆菌重组表达载体及其应用。本发明通过挖掘、优化出高强度启动子与核糖体结合位点序列片段，基于整合型过表达的遗传操作方法，以质粒pMV306为载体骨架串联甾体类药物生物转化过程中相关酶的基因整合得到一种重组表达载体，将之电转导入新金色分枝杆菌，构建得到一种基因工程菌，可在新金色分枝杆菌的基因组水平上以单拷贝的形式实现甾醇代谢路径中的关键酶或限速酶的过表达，且过表达的强度和稳定性优异。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新金色分枝杆菌重组表达载体及其应用。

背景技术

甾体类药物是人类治疗疾病中最重要的药品之一，目前已经有超过300种药物获得上市批准。全球制药行业每年对类固醇物质的需求超过1500吨，其中大部分用于生产类固醇类药物。据2018年统计数据显示，全球类固醇药物市场规模超过1200亿美元，仅次于抗生素市场。类固醇或甾体类药物涵盖了肾上腺皮质激素、性激素、黄体酮、盐皮质激素和非激素类固醇等多种类型，广泛应用于医药、兽药、农业、食品工业等领域。

在甾体类药物领域，化学合成是传统合成的主导方法。有关薯蓣植物中的薯蓣皂素结构与甾体药物类似，因此通过化学合成方法可制备多种甾体药物。但由于薯蓣植物来源不稳定且提取成本较为昂贵，难以满足当下市场需求。目前，植物甾醇的微生物转化已逐步取代传统的化学合成路线，成为制备甾体类药物的主要方式之一。此方法可生产多种甾体类药物以及中间体，如睾酮(TS)、宝丹酮(BD)、4-雄烯-3,17-二酮(AD)、1,4-雄二烯-3,17-二酮(ADD)、22-羟基-23,24-双降胆甾-4-烯-3-酮(4-HBC)、22-羟基-23,24-双降胆甾-1,4-二烯-3-酮(1,4-HBC)等。

新金色分枝杆菌具有较为显著的代谢可塑性，能够降解植物甾醇生产多种甾体激素药物及中间体。为了更好地将有限菌体代谢通量导向目标中间体的合成，需要更加高效的表达方式去过表达分枝杆菌中甾醇代谢路径中的关键酶或限速酶，提高菌体的生产效率。然而，目前在大部分新金色分枝杆菌的基因过表达研究中，都依赖于游离型多拷贝型质粒pMV-261和热休克蛋白hsp60启动子。其中pMV-261具有一个来源于偶发分枝杆菌质粒pAL5000的复制子OriM，使质粒具有多个拷贝数，而hsp60启动子来源于牛分枝杆菌。但依赖于质粒pMV-261和hsp60启动子过表达方式存在以下不足：游离型质粒由于质粒大小限制，过表达的基因数量有限；游离型质粒的稳定传代需要抗生素维持来确保；游离型过表达由于多个拷贝数，通常会增加菌体代谢负担，降低菌体生长速度：最明显的缺陷是hsp60启动子在驱动限速基因和外源基因时，强度相对不足，还有较大的提升空间。因此，目前较为单一的基因过表达方式，与常见的大肠杆菌和酿酒酵母等模式微生物相比时，存在较大差距。

所以，仍需出现一种新的表达载体的构建方法，来提高甾体代谢关键酶或限速酶在菌体的表达水平，进而提高甾体类药物前体的产量，以满足人们生产生活的需要。

发明内容

为了解决上述提高甾体代谢关键酶或限速酶表达的技术问题，本发明提供了一种新金色分枝杆菌重组表达载体及其应用。具体而言，本发明的目的为，在新金色分枝杆菌菌体基因组水平上，通过高强度启动子与核糖体结合位点RBS序列的挖掘和优化，通过整合型过表达的遗传操作方法，构建一种新金色分枝杆菌表达载体，实现分枝杆菌生物转化甾体药物关键限速酶的稳定过表达。

本发明的具体技术方案为：

一方面，本发明提供了一种新金色分枝杆菌重组表达载体，该重组表达载体由以下方法构建而成：

将启动子及核糖体结合位点序列片段插入载体骨架，并在所述载体骨架中连接甾体类化合物生物转化过程中相关酶的基因片段；

其中，所述启动子及核糖体结合位点序列片段的核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6。