[发明专利]组合物在矫正基因突变中的应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及组合物在矫正基因突变中的应用。本发明利用非重组病毒载体CRISPR/Cas9基因编辑技术定向矫正视网膜色素变性患者来源诱导多能干细胞系PRPF6基因突变(c.G2699A)，通过药物抗性筛选和富集，成功获得基因矫正的诱导多能干细胞系。本发明获得的诱导多能干细胞系来源于患者，而且具有三胚层分化的能力，可为研究该疾病的发病机制和治疗提供了更加合适的模型。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及组合物在矫正基因突变中的应用。

背景技术

视网膜色素变性是一种常见的遗传性视网膜疾病，以进行性光感受器细胞和视网膜色素上皮退行性变为特征。据统计，视网膜色素变性在世界范围内发病率约为1/4000。通常儿童或青少年开始发病，典型临床表现为夜盲，伴有进行性视野缩小、眼底特征性骨细胞样色素沉着和视网膜电图异常或无波形，最终可导致失明。视网膜色素变性具有高度的遗传异质性，大多数呈单基因遗传，常见的遗传方式有常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传和X性连锁隐性遗传三种。

PRPF6基因位于20号染色体上，其突变导致的是一种常染色体显性遗传的视网膜色素变性疾病。PRPF6编码的剪接因子蛋白负责参与剪接体的形成以及前体mRNA的剪接过程，在体内基因表达的生理过程发挥着重要的作用。目前，关于PRPF6基础研究的报道较少，缺少合适的细胞或动物模型，且其致病机制尚未完全明确。

CRISPR/Cas9是一种使用gRNA序列和Cas9核酸内切酶的第三代新型基因编辑技术。与传统的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9具有设计简单、价格低廉、打靶效率高、实验周期短等优点，现已广泛用于再生医学、生命科学和分子药学领域。CRISPR/Cas9作为对特定DNA序列进行修饰的“分子剪刀”，主要依赖于经基因工程改造的Cas9核酸内切酶，通过在gRNA序列的引导下特异性切割靶DNA双链，诱导细胞内的非同源末端连接或同源重组修复机制从而实现基因定向修饰。CRISPR/Cas9系统分为重组病毒载体和非重组病毒载体。本发明利用非重组病毒载体CRISPR/Cas9基因编辑技术来纠正患者来源诱导多能干细胞系的PRPF6基因点突变(c.2699GA)，从而有利于研究疾病的病理机制，以及为未来的精准基因治疗提供新的策略。

迄今为止，视网膜色素变性尚无有效的治愈方法，目前主要限制于补充维生素、叶黄素、神经营养因子和眼内视网膜假体植入等。这些疗法无法解决基因突变的分子机制问题。其中，视网膜假体植入手术治疗不仅价格昂贵、使用周期有限，而且还会引起一系列免疫排斥反应。因此，提供能够修复PRPF6基因突变的技术具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供组合物在矫正基因突变中的应用，矫正视网膜色素变性患者来源诱导多能干细胞系PRPF6基因突变。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了sgRNA在如下方面中的应用：

(I)、制备治疗PRPF6基因突变的产品；或

(II)、制备矫正诱导多能干细胞PRPF6基因突变的产品；或

(III)、制备治疗视网膜色素变性的产品；

所述sgRNA具有：

(1)、如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或

(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或若干个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；

所述若干个为2个至5个。

本发明还提供了表达载体，包括载体骨架和sgRNA，以及可接受的基因元件；