[发明专利]一种Caco-2+NCI-H716与Beta-TC-6双层共培养细胞模型的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种Caco‑2+NCI‑H716与Beta‑TC‑6双层共培养细胞模型的构建方法及应用，属于细胞培养技术领域。本发明针对现有技术中的细胞模型不能用于评价DPP‑4抑制肽的促胰岛素释放效果的技术问题，将Caco‑2细胞与NCI‑H716细胞融合培养于细胞培养板的AP侧并使其分化21天，形成同时具有分泌DPP‑4与GLP‑1的细胞单层结构，用于模拟正常生理条件下，DPP‑4抑制肽吸收转运过程对GLP‑1水平的综合影响；此外，将Beta‑TC‑6细胞接种在细胞培养板的BL侧，用于研究GLP‑1介导的DPP‑4抑制肽促进胰岛素释放的效果。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种Caco-2+NCI-H716与Beta-TC-6双层共培养细胞模型的构建方法及应用。

背景技术

2型糖尿病(T2D)是由胰岛素抵抗伴随胰岛素分泌不足所引起的，以高血糖为特征的一类代谢性疾病。因此，有效促进胰岛素的分泌和利用对T2D的治疗至关重要。与静脉注射相比，口服补充葡萄糖能刺激更多的胰岛素分泌，这是由于葡萄糖到达肠道后可刺激某些具有促进胰岛素释放功能的肠道激素，如：胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的分泌，此现象也被称为肠促胰岛素效应。除葡萄糖以外，其他宏量营养素如蛋白质亦可刺激肠道分泌GLP-1，以促进餐后胰岛素的释放。然而，GLP-1从肠道释放后迅速被二肽基肽酶-4(DPP-4)降解，最终导致其促胰岛素分泌活性下降。基于以上原因，两类降糖药物(GLP-1类似物与DPP-4抑制剂)已被开发并用于T2D的临床治疗。然而，这些合成药物可能会导致一些不良反应。因此，从天然食物来源挖掘具有刺激GLP-1分泌以及抑制DPP-4活性的功能性成分对于血糖管理具有重要意义。除了刺激GLP-1分泌外，蛋白质中所含的特定肽段还具有良好的DPP-4抑制活性，其可通过减缓GLP-1的降解来调节葡萄糖稳态。目前，已从乳品、鱼类、鸡蛋以及谷物等多种食品中获得了大量高活性的DPP-4抑制肽，这些DPP-4抑制肽表现了出良好的降血糖效果。

DPP-4抑制肽的降血糖机制是通过抑制DPP-4对GLP-1的降解来提升GLP-1的水平，进而刺激更多的胰岛素分泌。关于DPP-4抑制肽的降血糖效果评价主要有体外化学法，细胞实验，动物实验以及临床试验。其中，体外化学法具有简单快速的特点，但该方法生物相关性较差；动物实验或者临床试验具有很好的生物相关性，但其操作复杂、耗时长且费用高。细胞实验正好介于两者之间，具有较好的生物相关性与便捷性。由于Caco-2细胞可分泌大量DPP-4酶，目前已开发出基于Caco-2细胞的模型用于评价多肽DPP-4抑制活性。但是，该细胞模型有一个严重的缺陷，即Caco-2细胞并不分泌GLP-1，因此其只能用于评价DPP-4抑制肽的in situ DPP-4抑制活性，而不能评价由DPP-4抑制导致的GLP-1分泌增加，更不能评价GLP-1介导的DPP-4抑制肽促进胰岛素释放效果。因此，开发一种方便、高效且生物相关性更好的细胞模型用于评价DPP-4抑制肽的促胰岛素释放效果已成为当务之急。目前已有Caco-2细胞系构成的细胞共培养模型用于评价活性物质吸收后所发挥的生物活性。例如专利CN115305230A开发了一种脂多糖诱导的Caco-2/RAW264.7细胞共培养模型用于研究矢车菊素-3-葡萄糖苷经肠道吸收代谢后在循环系统的抗炎活性。但是，用于评价DPP-4抑制肽的促胰岛素释放效果的细胞共培养模型还未有报道。

发明内容

为解决现有技术中的细胞模型不能用于评价DPP-4抑制肽的促胰岛素释放效果的技术问题，本发明通过构建Caco-2+NCI-H716以及Beta-TC-6细胞系组成的共培养细胞模型用于评价GLP-1介导的DPP-4抑制肽的促胰岛素释放效果。

为了实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种Caco-2+NCI-H716与Beta-TC-6双层共培养细胞模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：